高效液相色谱法测定不同产地蜘蛛香中橙皮苷的含量

高效液相色谱法测定不同产地蜘蛛香中橙皮苷的含量

蜘蛛香是指打败坎贝尔植物的蜘蛛香valendarajatamansius的干燥根系和根茎。蜘蛛香气又名司马香、虎七和印度虎草，属于错塘植物。主要产于贵州、云南等地。临床主要用于消化不良、腹痛、止水泻、流感、镇静、安定等。橙皮苷(hesperidin)是蜘蛛香的主要成分之一,含量高、稳定性好,据报道,橙皮苷也具有镇静和催眠作用,是新发现的作用于中枢神经系统的黄酮类化合物,为控制蜘蛛香药材品质,对贵州不同产地蜘蛛香中橙皮苷进行了高效液相色谱法(HPLC)含量测定。1药品、生物线性关系测定紫外可见分光光度仪:岛津UV-2550型分光光度仪;高效液相色谱仪:岛津LC-2010ATH液相色谱仪,LC-solution色谱工作站。色谱柱为DiamonsilC18(200mm×4.60mm,5μm);橙皮苷对照品(110721-200512)购自中国药品生物制品检定所;蜘蛛香药材产自贵州省各地,经贵阳中医学院陈德媛老师鉴定为败酱科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones;甲醇为色谱纯,水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯。2方法和结果含量测定:检测波长的选择,经对橙皮苷对照品溶液进行紫外扫描,发现在283nm处为最大吸收峰值。因此,选择283nm作为检测波长。2.1对照溶液的制备精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每毫升约含40μg的溶液。2.2供试品溶液及色谱条件取本品粉末0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,密塞,摇匀,称定重量,水浴加热回流30min,放至冷却,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。取续滤液过0.45μm的微孔滤膜,滤液作为供试品溶液。色谱条件及含量测定:色谱柱为DiamonsilC18(200mm×4.60mm,5μm),柱温30℃;流动相为甲醇-醋酸-水(35∶4∶61);检测波长为283nm,流速1.0ml/min。2.3测量法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,进行含量测定。2.4标准曲线绘制精密吸取上述橙皮苷对照品溶液2、6、10、14、18、22μ注入高效液相色谱仪,依法测定,以峰面积为纵坐标,橙皮苷浓度为横坐标,绘制标准曲线,线性回归方程:Y=2E+0.9X+350.56,R2=1。结果表明,橙皮苷在0.07718～0.84876μg范围内具有良好的线性关系。见图1。2.5准确度的研究取同一对照品,分别重复进样5次,对照品溶液中橙皮苷RSD=0.46%(n=5)。2.6试验操作及结果取本品6份,精密称定样品,按“样品含量测定”项下的方法操作,制成供试品溶液,测定橙皮苷的平均含量为1.89mg/g,RSD为1.7%(样品为兴义坡岗镇产)。2.7稳定实验将配置好的供试品溶液在室温下放置,分别于0、2、6、10、14、16h测定,结果样品溶液在16h内基本稳定,RSD为1.64%。2.8试验品及加样回收率精密称取已知含量的样品共6份,分别加入等量橙皮苷对照品,照供试品方法制备,测定含量,橙皮苷平均回收率为102.32%,RSD=1.95%(n=6)。见表1。2.9根据测定了蜘蛛中橙色含量按“2.2”项方法,制备供试品溶液,测定蜘蛛香药材中橙皮苷的含量,测定结果见表2。2.10对照品a和寄生虫样本bhplc图见图2。3加热回流提取实验中采用橙皮苷对照品溶液进行紫外扫描,发现283nm处为最大吸收峰,故采用283nm作为本实验的检测波长。对提取方法进行考察,比较超声、加热回流和冷浸的提取效果,发现加热回流提取的橙皮苷分离较好,橙皮苷的含量也明显大于其他2种提取方法,因此,本实验的样品采用加热回流提取。对提取溶剂进行考察,比较甲醇、70%乙醇、50%甲醇的加热回流提取效果,发现甲醇加热回流提取的橙皮苷分离较好,且橙皮苷的峰面积也明显大于其他2种提取溶剂,故选择甲醇作提取溶剂。对加热回流提取时间进行考察,比较了10、30、40、60min的加热回流提取效果,橙皮苷在30～60min的含量区别不明显,因此,本实验的样品提取时间采用30min。对色谱柱的考察,比较依利特色谱柱和迪马色谱柱的分离效果,依利特色谱柱和迪马色谱柱的分离效果都不错,本实验选用迪马色谱柱。对流动相的考察,比较乙腈∶水∶磷酸(15∶85∶0.02)和甲醇醋酸∶水(35∶4∶61)分离效果及出峰时间,甲醇∶醋酸∶水(35∶4∶61)较乙腈∶水∶磷酸(15∶85∶0.02)好。不同产地的蜘蛛香中橙皮苷含量变化范围较大,其中,以兴义市