香果健消片中橙皮苷的鉴别和含量测定

香果健消片中橙皮苷的鉴别和含量测定

香果健消片是将蜘蛛、木香、草果等医疗材料提取而成的中药制剂。它对健胃和消食也很有效。用于消化不良、肿胀、胸闷、腹胀、胸闷。现行质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂,该质量标准中,只用香草醛进行显色鉴别,无专属性较强的薄层色谱鉴别和含量测定方法。为了保证本品的用药安全,更好地控制药品质量,本实验对方中主药蜘蛛香进行薄层色谱法(TLC)鉴别,并采用高效液相色谱法(HPLC)测定其主要化学成分橙皮苷的含量。1设备和材料1.1高效液相色谱法Agilent1200高效液相色谱仪(包括G1311A四元泵、G1314B可变波长、G1316A柱温箱、G1329A自动控温进样器、G1322A真空脱气机);AgilentXBP-C18(4.6×250mm,5μm)分析柱;电子分析天平(瑞士梅特勒AL204-IC);薄层色谱成像仪(武汉药科新技术开发有限公司YOKO-ZS);超纯水机(台湾艾柯纯水设备厂KL-UP-UV-20);超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司SB5200DT)。1.2生物化学成分对照品香果健消片(云南云河药业有限公司生产,批号:090603,090706,090802,081201);橙皮苷对照品(批号:110721-200613,中国药品生物制品鉴定所提供);硅胶G(青岛海洋化工有限公司生产);甲醇为色谱纯(美国Fisher公司);水为超纯水;其它试剂均为分析纯。2识别标记2.1对照品贮备液的制备精密称取橙皮苷对照品5.050mg,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成0.505mg/mL的对照品贮备液。精密移出上述溶液400μL,用甲醇稀释至1.0mL,即得对照品溶液(含橙皮苷0.202mg/mL)。2.2供试品溶液的制备称取不同批号(090603、090706、081201)各10片,去糖衣,精密称定,研细,各取约1.0g,精密称定,加入20mL甲醇,称定重量,25℃超声提取30min,放冷,滤过,滤液置水浴上挥干,残渣各加入2.0mL甲醇,溶解,即得供试品溶液1,2,3(批号分别为090603、090706、081201)。2.3由蜘蛛香生产的药物按处方制备蜘蛛香对照药材,再按“2.2”项制备,即得蜘蛛香对照药材溶液。2.4阴性对照溶液的制备按处方制备缺蜘蛛香的阴性对照品,再按“2.2”项制备,即得阴性对照品溶液。2.5苯甲酰胺盐的合成参照TLC试验,用毛细吸管吸取上述供试品、对照品、对照药材、阴性对照溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶15)的上层溶液为展开剂,进行一次展开,展至约6cm,取出,晾干。再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶3)为展开剂,进行二次展开,展开至16cm,取出,晾干,喷以3%AlCl3溶液,在110℃下加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品、对照药材色谱相应的位置上,分别显相同颜色的荧光斑点,阴性对照无相应的荧光斑点。见图1。3重量测定3.1流动相冰醋酸色谱柱:AgilentXBP-C18分析柱(4.6×250mm,5μm);流动相:甲醇-5%冰醋酸溶液(35∶65);检测波长283nm;柱温35℃;流速1.0mL/min。理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于2500。3.2试验溶液的制备3.3阴性对照溶液的制备取缺蜘蛛香的阴性对照样品0.5g,按“3.2”项供试品溶液的制备方法制备,即得。3.4色谱干扰试验精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5μL,分别注入液相色谱仪,结果供试品色谱中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰,阴性对照品在橙皮苷对照品相同保留时间处未显色谱峰,故认为无干扰。见图2。3.5橙皮苷标准曲线按“3.1”项色谱条件,取0.202mg/mL的对照品溶液,分别以1,2,5,8,15,20μL进样测定,以橙皮苷的峰面积峰值为纵坐标,进样量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:y=2036.6X+10.554(r=0.9999)。结果表明,橙皮苷在0.202~4.040μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。3.6精密度测试按“3.1”项色谱条件,取0.202mg/mL的对照品溶液连续6次进样,峰面积的RSD为0.83%。结果表明,仪器精密度良好。3.7峰面积按“3.1”项色谱条件,按“3.2”项制备供试品溶液,在0,2,4,6,8,10,12h各进样1次,测定供试品溶液中橙皮苷峰面积值,所得橙皮苷的峰面积RSD为2.75%。结果表明:供试品溶液中橙皮苷12h内稳定。3.8试验品溶液制备取同一批号(090603)样品6份,按“3.2”项制备各供试品溶液,并按“3.1”项色谱条件进行测定,橙皮苷的含量为0.85mg/片,RSD为2.43%。3.9加样回收率试验取已知含量的同一批号(090603)样品6份,每份约0.45g,精密称定,各加入橙皮苷贮备溶液(0.505mg/mL)1mL,按“3.2”项供试品溶液制备方法制备,按“3.1”项色谱条件测定,计算回收率。见表1。3.10样品含量的测量取4个不同批号的药品,按“3.2”项供试品溶液制备方法制备,按“3.1”项色谱条件测定,计算。结果见表2。4色谱条件筛选橙皮苷在甲醇中易溶解,故在薄层色谱鉴别、HPLC测定橙皮苷时选用甲醇作溶剂。原质量标准中“鉴别”属化学鉴别,由于其专属性不强,故本实验采用TLC对香果健消片中蜘蛛香主要化学成分橙皮苷进行了薄层鉴别。对薄层条件进行优化:考察了不同比例的展开剂(乙酸乙酯-甲醇-水、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水)系统,结果采用乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶15)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶3)为展开剂。供试品色谱中,在与对照品相应的位置上显相同颜色的荧光斑点,有5个斑点与对照药材相对应,阴性对照无相应的荧光斑点。试验结果表明阴性对照溶液对供试品均无干扰,专属性强、斑点清晰,特征斑点分离效果良好,斑点无拖尾现象,故此方法可用作香果健消片中橙皮苷的鉴别。对制剂中橙皮苷进行含量测定研究,为了在短时间内获得好的分离效果,对色谱条件进行了优化:首先,考察了不同组成和比例的流动相(乙腈-水、甲醇-水)系统,酸主要比较了冰醋酸和磷酸。结果乙腈-水系统分离效果不如甲醇-水系统,且在甲醇-水系统中加入5%的冰醋酸可提高分离效果。综合考虑各因素后确定采用甲醇-5%冰醋酸溶液(35∶65)为流动相进行洗脱。其次,考察了不同的波长(280、283nm)、不同的柱温(25、30、35℃),最后确定波长为283nm、柱温为35℃。在上述条件下,