炎性乳腺癌裸鼠动物模型的建立及其生物学特性的检测

炎性乳腺癌裸鼠动物模型的建立及其生物学特性的检测

在肿瘤转移过程中，很难确定肿瘤细胞如何进入微血管和血管，然后转移到远方器官的机制。然而，营射性乳腺（ibc）是乳腺癌最易传播的疾病。炎性乳腺癌是乳腺癌中恶性程度最高、发展速度最快的恶性肿瘤,其发病率为1%～10%不等,有很强的区域性,我国发病率为2%,此外在贫穷地区的炎性乳腺癌的发病率较发达地区高。在临床上,炎性乳腺癌主要表现为乳房区域的红肿和皮肤橘皮样改变,同时伴有乳房的巨大肿块和肿大的淋巴结,并伴有极高的局部复发和远处脏器的转移。在组织学上,炎性乳腺癌主要表现为癌细胞广泛浸润于皮肤层和皮肤乳头状层的淋巴管内,癌细胞呈低分化状,以及肿瘤细胞的远处转移和淋巴管内的癌细胞的浸润。肿瘤细胞的远处转移往往是引起肿瘤治疗失败的主要原因。我们所建立的人类炎性乳腺癌移植肿瘤裸鼠动物模型为肿瘤转移机制的研究提供了一个极好的模型。材料和方法一、材料表面1.化学试剂MEM培养基和小牛血清购于美国的GIBCO公司,[α-32P]dCTP(3000Ci/mmol)购于美国Amersham公司。2.mda-mb-133、mda-mb-400生长原理雌激素受体(ER)阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468购自美国ATCC,所有细胞都生长在MEM加10%的小牛血清中。3.肿瘤直径大小时传代移植经病理诊断证实的女性炎性乳腺癌标本移植至雌性裸鼠(BALB/c)皮下,当移植肿瘤直径长至1cm时进行传代移植,迄今已成功传了10代。同时我们对该移植肿瘤的致瘤性、生长率、转移倾向和生物学特性进行了检测,并和非炎性乳腺癌移植瘤MDA-MB-231和MDA-MB-468进行了比较。二、实验方法1.纤维膜的改性杂交RNA的分离采用Chromczynski的方法,20μg的RNA样本在1%含0.66mmol/L甲醛的琼脂胶分离,然后转移至硝酸纤维膜上,经负压、80℃高温烘烤2h,纤维膜进行杂交,在特异性杂交前,纤维膜至少在42℃进行6h的封闭,然后经含有同位素特异性标记探针的特异性杂交液杂交24h,经2×SSPE+0.2%十二烷基磺酸钠清洗后,经放射自显影曝光显色。2.非炎性乳腺癌移植瘤的色检测系统Western印迹法是采用标准的ECL荧光显色检测系统。我们比较了炎性乳腺癌移植瘤模型和其他非炎性乳腺癌移植瘤在多种分子物质的区别。ECL检测系统购至美国Amersham公司。3.酶谱分析方法基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)采用直接的酶谱分析法。炎性乳腺癌移植肿瘤裸鼠模型生物学特性我们成功地建立了人类炎性乳腺癌移植肿瘤裸鼠模型。和人类炎性乳腺癌一样,炎性乳腺癌移植肿瘤裸鼠模型也呈现炎性样表现,如移植肿瘤的皮肤红肿等(图1)。在显微镜下也呈现肿瘤细胞的淋巴管和血管浸润(图2,3)。该移植肿瘤裸鼠模型还呈现肿瘤细胞的肺转移特征,当移植肿瘤长至1.5～2.0cm时,在肺组织中可见肿瘤细胞栓在肺血管内的现象(图4)。在对炎性乳腺癌移植肿瘤裸鼠模型生物学特性的检测中发现该移植肿瘤表现为ER阴性,孕激素受体(PR)阴性、p53强阳性、表皮生长因子受体(EGFR)过度表达以及Her-2/neu过度表达等;在DNA含量检测中,我们应用特异性的Cot-1探针发现所形成的炎性乳腺癌裸鼠动物模型含有约30%裸鼠的DNA含量,提示人类炎性乳腺癌细胞能分泌某种物质刺激裸鼠在肿瘤组织的血管和淋巴管的形成,而在MDA-MB-231所形成的裸鼠移植肿瘤中仅含有极少量的裸鼠DNA含量。同时在进行了一系列粘附因子家族、血管生成因子家族以及蛋白酶家族的表达筛选实验,和其他非炎性乳腺癌移植瘤相比,我们发现炎性乳腺癌移植瘤仅表达非常高的E-Cadherin和MUCI,而其他因子则无异常表达,提示这2种蛋白在炎性乳腺癌的生物学特性中具有一定的作用。讨论一、血管生成因子家族在肿瘤的转移中,肿瘤细胞主要通过以下的环节而最后形成远处脏器的转移,即肿瘤细胞进入血管或淋巴管→在血液中循环→粘附于某一脏器的血管壁→离开血管→形成转移。在所有的这些环节中,肿瘤细胞如何进入血管系统的过程最为重要,也是最不清楚的一个环节。深入了解肿瘤细胞进入血管系统的作用机制,对于预防和治疗肿瘤的转移将具有十分重要的意义。初步的研究发现:粘附因子家族如整合素、免疫球蛋白类分子、选择素、CD44、粘蛋白;血管生成因子家族bFGF、aFGF、TGF-α、TGF-β、VEGF、Angiogenin等以及蛋白酶家族成员:72kDagelatinaseA、92kDagelatinaseB、stomelysin-1、u-PA、t-PA、Plasminogen等在肿瘤侵袭与转移过程起重要作用;炎性乳腺癌是人类乳腺癌中恶性度极高的一种特殊类型,进一步探讨并筛选决定炎性乳腺癌生物学特征的分子将有助于阐明肿瘤侵袭与转移的机制。二、炎性乳腺癌发病率低炎性乳腺癌是人类乳腺癌中恶性度极高一种特殊类型,迄今为止,尚无自发动物模型报道。炎性乳腺癌发病率低,仅占所有乳腺癌的1%,临床病例少,且多为晚期病例而失去手术时机,标本难以获得。我们成功地建立了炎性乳腺癌裸鼠动物模型,为深入探索炎性乳腺癌的生物学特征提供了的较好的研究模型。三、炎性乳腺癌的裸鼠移植肿瘤动物模型我们检测证实该动物模型所表现的为人类炎性乳腺癌的生物学特征,如癌细胞的淋巴管内浸润、移植肿瘤表面红肿等,同时也发现该肿瘤动物模型在移植12周、当肿瘤直径达1cm时可发现有肺部的远处转移。在对其生物学特性的检测中发现该移植肿瘤表现为ER阴性、PR阴性、p53强阳性、EGFR过度表达以及Her-2/neu过度表达等,其移植肿瘤形成率为70%左右,其生长速度和ER阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231所形成的裸鼠移植肿瘤相似,但MDA-MB-231所形成的移植肿瘤在组织学上没有任何癌细胞浸润淋巴管的征象,同时也极少有远处脏器的肿瘤转移,在DNA指纹印记实验中发现所形成的炎性乳腺癌裸鼠动物模型含有约30%裸鼠的DNA含量,提示人类炎性乳腺癌细胞能分泌某种物质刺激裸鼠在肿瘤组织的血管和淋巴管的形成,而在MDA-MB-231所形成的裸鼠移植肿瘤中仅含有极少量的裸鼠DNA含量。同时在进行了一系列初步的筛选实验,和其他非炎性乳腺癌移植瘤相比,炎性乳腺癌移植瘤表达非常高的E-Cadherin蛋白和MUCI蛋白。而其他因子则无异常表达,提示这2种蛋白在炎性乳腺癌的生物学特性中可能起一定的作用,我们将进行这2种蛋白在炎性乳腺癌中的功能研究。炎性乳腺癌一个重要临床特征和组织学特征是肿瘤细胞的远处转移和淋巴管内的癌细胞的浸润,而肿瘤细胞的远处转移往往是引起肿瘤治疗失败的主要原因。由于炎性乳腺癌的主要表现为淋巴管内的癌细胞的浸润以及极高的远处脏器转移的倾向,所以通过对炎性乳腺癌的研究很可能会发现导致肿瘤细胞进入微血管、血管而转移至远处脏器的分子基础,同时可以设想在在炎性乳腺癌中引起癌细胞的淋巴管浸润和血管转移主要是受到了肿瘤细胞的某些特定的遗传