第一章 非细胞结构的超微生物-病毒

第一篇微生物学基础

第一章非细胞结构的超微生物

——病毒大家谈病毒（virus)病毒的发现和研究历史1886年，A.Mayer发现具有传染性的烟草花叶病；1892年，D.Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：一种能通过细菌滤器的”细菌毒素”或极小的细菌1898年，MWBeijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：

能通过细菌滤器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性，能在琼脂凝胶中扩散；用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活；比细菌小的具有传染性的活的流质（contagiumvivumfluidum）1900年前后，包括口蹄疫（footandmouthdisease）在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。filterableviruses（滤过性病毒）viruses（病毒）FWTwort（1915年）、Fd’Herelle（1917年），分别发现细菌（Shigelladysenteriae）病毒bacteriophagesPhago,toeat噬菌体（phage）1935年，WMStanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；

Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒；极大地丰富了现代生物学（微生物学、分子生物学、分子遗传学）的理论与技术；有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业；灭活用于医疗。

第一节病毒的一般特征及其分类

第二节病毒的形态和结构

第三节病毒的繁殖

第四节

病毒的测定与培养

第五节病毒对物理、化学因素、抗生素的抵抗力及在污水处理过程的去除效果

第六节病毒的危害、对策与应用第一节病毒的一般特征及其分类

一、病毒的特征超微小，可通过细菌过滤器；没有细胞结构，只具简单的独特结构；没有核糖体，也没有合成细胞物质和繁殖所必备的酶系统，不具独立的代谢能力；专性寄生在活的敏感宿主体内；在体外呈现为大分子物质，保留感染宿主能力。1）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征。2）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNA或者RNA。3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢的酶，不能进行独立的代谢作用。4）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。例如一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coat）构成，故可把它们视为核蛋白分子。朊病毒甚至仅由蛋白质构成病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。超显微的、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体

二、病毒的分类

1971年以后，国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeforTaxonomyViruses,ICTV）建立了统一的病毒分类系统。在2005年7月第八次发布：将病毒分为3个目，73个科，11个亚科，289个属，1950个种。

病毒分类是根据宿主、所致疾病、病毒粒子的大小、病毒的结构和组成，核酸的类型、复制的模式，有或无被膜等进行。

二、病毒的分类

1.根据专性宿主分类动物病毒植物病毒细菌病毒(噬菌体)

放线菌病毒(噬放线菌体)

藻类病毒(噬藻体)

真菌病毒(噬真菌体)

2.按核酸分类

DNA病毒多数是双链DNA，细小病毒组的成员是单链DNA。

RNA病毒多数是单链RNA，呼肠孤病毒组的成员是双链RNA。单链DNA和单链RNA又有正链和负链之分。三、类病毒和朊病毒

类病毒类病毒比病毒更加小，为环状单链RNA，约有250～370个核苷酸长度，可通过机械途径或花粉或胚珠在植物间传播，在宿主内复制。类病毒可引起马铃薯纺锤形块茎病、柑橘裂皮病和菊矮化病。朊病毒朊病毒是一种引起牛、羊疾病的感染因子（蛋白样感染颗粒）。没有检测到核酸存在。朊病毒可导致退化性神经系统紊乱的疾病，如羊瘙痒症。可引起人和动物的神经性疾病，如牛海棉状脑病（BSE或疯牛病）致使家族性痴呆。

第二节

病毒的形态和结构

一、病毒的形态和大小（一）病毒的形态

动物病毒的形态：球形、卵圆形、砖形等。植物病毒的形态：杆状、丝状和球状。噬菌体的形态：蝌蚪状和丝状(图1-1)。

个体小，必需在电镜下观察；不同病毒的毒粒大小差别很大；采用各种电镜技术观察毒粒的形态结构Orfvirus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎病毒)（负染技术）Ebolavirus：埃博拉病毒（正染技术）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技术）1典型的病毒粒子

核衣壳病毒粒子包膜核心：DNA或RNA衣壳：衣壳粒蛋白2构型(1)烟草花叶病毒(TMV)---螺旋对称衣壳衣壳蛋白：占95%，2130个衣壳粒核心RNA：占5%，ssRNA300nm÷2.3nm/圈=130圈130圈 ×161/3个/圈=2130

(2)腺病毒(ADENOVIRUS)---二十面体立体对称1953年发现形状：二十面体腺质体致病性：消化道炎症等。12个顶角20个面30个边衣壳：252个衣壳粒

12个五邻体，240个六邻体核心：dsDNA，线状若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体，以二十面体容积为最大，能包装更多的病毒核酸，所以病毒壳体多取二十面体对称（icosahedralsymmetry）结构。(3)T偶噬菌体---复合对称

头部尾部目前噬菌体基本形态分为3种蝌蚪形>微球形>丝状椭圆形20面体衣壳粒212内含DNA和中心蛋白螺旋对称衣壳粒144个注射核酸的通道（二）病毒的大小动物病毒痘病毒(poxvirus)：高×宽×长度：100×200×300nm，口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)：直径：22nm。植物病毒马铃薯Y病毒(potatovirusY)：长度×直径：750nm×12nm

南瓜花叶病毒(squashmosaicvirus)：直径：22nm。噬菌体大肠杆菌噬菌体T２、T４、T６：头部长度×直径：90nm×60nm，尾部长度×直径：100nm×20nm。大肠杆菌噬菌体f２：直径为25nm。大肠杆菌噬菌体M13：丝状，长度为600～800nm。图1-1几种病毒的形态与相对大小（大圆表示葡萄球菌细胞的相对大小）1.葡萄球菌噬菌体2.烟草花叶病毒3.疱疹病毒4.腮腺炎病毒5.流感病毒6.脊髓灰质炎病毒7.狂犬病毒8.腺病毒9.痘病毒

二、病毒的化学组成及结构

（一）病毒的化学组成

蛋白质核酸类脂质多糖

核酸是病毒的遗传物质；

一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA；病毒的蛋白质病毒蛋白质结构蛋白非结构蛋白病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质壳体蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；病毒的蛋白质病毒结构蛋白的主要生理功能：1）构成蛋白质外壳，保护病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子的破坏；2）决定病毒感染的特异性，与易感细胞表面存在的受体具特异性亲和力，促使病毒粒子的吸附和入侵；3）决定病毒的抗原性，能刺激机体产生相应的抗体；4）构成毒粒酶，或参与病毒对宿主细胞的入侵（如T4噬菌体的溶菌酶等），或参与病毒复制过程中所需要病毒大分子的合成（如逆转录酶等）；一般来说，病毒是不具酶或酶系极不完全的，所以一旦离开宿主就不能独立进行代谢和繁殖。图1-2病毒的结构病毒的构型图1-3病毒的对称构型A.立体对称型(20面体)(腺病毒)B.复合对称型(T系噬菌体)

图1-4SARS病毒(冠状病毒) A.SARS病毒的结构图B.电子显微镜下的SARS病毒图1-5H5N1型禽流感病毒

（二）病毒的结构

1.蛋白质衣壳

病毒的构型第一种是立体对称型，主要为20面体(图1-3，A)如腺病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒等。图1-4的SARS病毒和图1-5的禽流感病毒。第二种为螺旋对称型，如烟草花叶病毒、狂犬病毒、流感病毒、正粘病毒。第三种为复合对称型，如大肠杆菌T系噬菌体，它的头部呈立体对称型(20面体)，尾部为螺旋对称型(图1-3,B)。蛋白质衣壳的功能保护病毒使其免受环境因素的影响；决定病毒感染的特异性，使病毒与敏感细胞表面特定部位有特异亲和力，病毒可牢固地附着在敏感细胞上；病毒蛋白质还有致病性、毒力和抗原性。

（二）病毒的结构

2.病毒的核酸

DNA(脱氧核糖核酸)RNA(核糖核酸)

动物病毒有的含DNA，有的含RNA。植物病毒大多数含RNA，少数含DNA。噬菌体大多数含DNA，少数含RNA。病毒核酸的功能决定病毒遗传、变异和对敏感宿主细胞的感染力。

3.被膜(囊膜)

类脂质中50%～60%为磷脂，其余为胆固醇。具有被膜病毒：痘病毒、腮腺炎病毒、流感病毒等。痘病毒含糖脂和糖蛋白。病毒不具完备的酶系统，但在病毒的壳体中含有核酸多聚酶。第三节

病毒的繁殖

一、病毒的繁殖过程

(一)吸附

(二)侵入

(三)复制与聚集

(四)宿主细胞裂解和成熟噬菌体粒子的释放裂性噬菌体增殖Adsorption:

duringtheLyticLifeCycleofaLyticBacteriophage

Thebacteriophagebindstoreceptorsonthebacterialcellwall.1)吸附(附着)(adsorption,attachment)Penetration:duringtheLyticLifeCycleofaLyticBacteriophageThebacteriophageinjectsitsgenomeintothebacterium'scytoplasm.2)侵入(Penetration)EarlyReplication:duringtheLyticLifeCycleofaLyticBacteriophageThebacteriophagegenomereplicatesandbacteriophagecomponentsbegintobeproducedbywayofthehostbacterium'smetabolicmachinery.

3)核酸复制(nucleicacidreplication)LateReplication:duringtheLyticLifeCycleofaLyticBacteriophageTheproductionofbacteriophagecomponentsandenzymesprogresses.

Maturation:duringtheLyticLifeCycleofaLyticBacteriophageThebacteriophagecomponentsassemble.4)噬菌体装配(Phageassembly)Abacteriophage-codedenzymebreaksdownthepeptidoglycaninthebacterialcellwallcausingosmoticlysis.

Release:duringtheLyticLifeCycleofaLyticBacteriophage5)释放(release)AnimationoftheLyticLifeCycleofaBacteriophage图1-6噬菌体吸附、侵入宿主菌内复制（合成）、聚集与释放全过程T-偶噬菌体感染大肠杆菌的扫描电镜噬菌体

大肠杆菌T4噬菌体感染大肠杆菌的电镜照片

大肠杆菌

噬菌体二、噬菌体的溶原性(lysogeny)1.噬菌体有毒(烈)性噬菌体：侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解(图1-7,A)的噬菌体。

2.温和噬菌体：侵入宿主细胞后，其核酸附着并整合在宿主染色体上，和宿主的核酸同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长(图1-7,B)，不引起宿主细胞裂解的噬菌体。溶原细胞：含有温和噬菌体核酸的宿主细胞。它具溶原性(lysogeny)，是遗传特性，原噬菌体随宿主细胞分裂传给子代细胞，子代细胞也成为溶原细胞。原噬菌体：在溶原细胞内的温和噬菌体核酸。在溶原性细菌内的原噬菌体没有感染力，它脱离溶原性细菌的染色体后可恢复复制能力，并引起宿主细菌裂解而释放出成熟的毒性噬菌体，这是溶原性发生变异所致。图1-7细菌受噬菌体感染后的两种反应A.裂解反应B.溶原性反应

溶原性噬菌体的命名

在敏感菌株的名称后面加一个括号，在括号内写上溶原性噬菌体λ。大肠杆菌溶原性噬菌体的全称为EscherichiacoliK１２(λ)

Escherichia是大肠杆菌的属名，

coli是大肠杆菌的种名，

K１２是大肠杆菌的株名，括号内的λ代表溶原性噬菌体。

第四节

病毒的测定与培养

一、病毒的测定（一）病毒颗粒计数法（二）间接计数法（三）病毒感染效价测定法

一、病毒的测定

（一）病毒颗粒计数法用电子显微镜直接计数。用于已知形态病毒的浓缩样品的计数。

测定方法：将病毒样品与已知浓度的乳胶小颗粒均匀混合，然后将混合液均匀喷洒在已包被的样品方格网上，分别计乳胶颗粒和病毒颗粒数目。病毒的浓度可由样品中两种颗粒的比例和乳胶颗粒浓度计算得出。（二）间接计数法血细胞凝集试验（hemagglutinationassay）计数

测定方法：分别将红细胞与一系列10倍稀释的病毒样品混合，再观察结果。以能引起血细胞凝集的最高稀释倍数（或稀释倍数的倒数）为病毒的效价。

（三）病毒感染效价测定法病毒感染效价测定法与病毒培养方法基本相同。

二、病毒的培养特征

（一）病毒在液体培养基中的培养特征

将噬菌体的敏感细菌接种在液体培养基中，经培养后敏感细菌均匀分布在培养基中而使培养基浑浊。然后接种噬菌体，敏感细菌被噬菌体感染后发生菌体裂解，原来浑浊的细菌悬液变成透明的裂解溶液(图1-8)。图1-8噬菌体在液体培养基中的内的培养特征

A.被噬菌体感染之前培养液浑浊

B.被噬菌体感染之后培养液变清

（二）病毒在固体培养基上的培养特征

将噬菌体的敏感细菌接种在琼脂固体培养基上生长形成许多个菌落，当接种稀释适度的噬菌体悬液后引起点性感染，在感染点上进行反复的感染过程，宿主细菌菌落就一个个地被裂解成一个个空斑，这些空斑就叫噬菌斑。

图1-8噬菌体在液体培养基中的内的培养特征

C.细菌菌落

D.四个菌落被噬菌体感染成噬菌空斑

三、病毒的培养基

病毒的培养基应具备的条件：①必须是活的敏感动物或是活的敏感动物组织细胞；②能提供病毒附着的受体；③敏感细胞内没有破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶，病毒进入细胞就可生长繁殖。

1.脊椎动物病毒培养基①人胚组织细胞②人组织细胞③人肿瘤细胞④动物组织细胞⑤鸡、鸭胚细胞⑥敏感动物

2.植物病毒的培养基

与相应的敏感植株和敏感的植物组织。

3.噬菌体的培养基

与噬菌体相应的敏感细菌，如大肠杆菌噬菌体用大肠杆菌培养。

三、病毒的培养基

四、病毒的培养

(一)病毒样品的采集与制备

病毒存在于动、植物病灶组织、体液、分泌物、粪便、下水污泥、活性污泥、污水、河水、湖水、海水等处。

固体病毒样品采得后，加液体培养基制成悬液，以10000r/min离心10min，去除杂质，取其上清液备用。

液体病毒样品

直接以10000r/min离心10min，去杂质，取其上清液备用。

空气病毒样品采用真空泵抽取至长有宿主菌的平板上，或是将长有宿主菌的平板打开盖，在空气中暴露30～60min以收集。若样品中病毒浓度大则要适当稀释，若样品中的病毒浓度小则要浓缩。四、病毒的培养和纯化

1、病毒的培养噬菌体细菌培养物培养液营养琼脂平板细菌培养液变清亮细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬斑（plague）。如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对噬菌体的数目进行估算。四、病毒的培养和纯化

1、病毒的培养植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称枯斑四、病毒的培养和纯化

1、病毒的培养动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养四、病毒的培养和纯化

（参见P161）1、病毒的培养若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。大多数动物病毒感染敏感细胞培养能引起其显微表现的改变，即产生致细胞病变效应（cytopathic