第11节 植物细胞代谢产物制备I

第四篇生物制品生产第9章植物细胞代谢产物制备I第9章内容安排：I：植物细胞培养II：植物细胞培养生产次级代谢产物的应用举例分析与讨论本节主要内容：1.植物细胞培养技术本节关键问题：1.植物细胞的特点2.植物细胞培养方式：悬浮培养、固定化培养3.植物细胞培养的生物反应器植物细胞培养得到的常见次级代谢物紫草宁小檗碱（黄连素）花青素，花黄素银杏黄酮银杏内酯白果内酯蒽醌青蒿素超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶香豆素薄荷醇人参皂甙类胰岛素紫杉醇地高辛利血平奎宁碱长春花碱尼古丁鱼腾酮迷迭香酸紫草细胞黄连细胞玫瑰茄细胞，紫苏细胞银杏细胞银杏细胞银杏细胞巴戟天细胞黄花蒿细胞大蒜细胞番木瓜细胞番木瓜细胞胡桐细胞，薰衣草细胞薄荷细胞人参细胞苦瓜细胞红豆杉细胞毛地黄细胞罗夫木细胞金鸡纳细胞长春花细胞烟草细胞鱼藤细胞鼠尾草细胞，鞘心花细胞色素，消炎消炎、止泻食用色素，抗氧化疏通血管，抗氧化治疗心血管疾病治疗大脑和神经系统疾病抗菌消炎，抗肿瘤抗疟疾，退热药抗氧化、抗辐射、抗衰老消炎，肉质嫩化治疗骨质增生，血型检测抗病毒，香精食用香精调节免疫功能，保健治疗糖尿病抗肿瘤强心药降血压抗疟疾治疗白血病杀虫杀虫消炎，抗氧化长春新碱长春碱长春花细胞培养生产生物碱治疗白血病银杏细胞培养生产黄酮、萜类化合物红豆杉细胞培养生产紫杉醇玫瑰茄等植物细胞培养生产色素洛神花什么是初级和次级代谢产物？初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。次级代谢产物

是指生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。一植物细胞培养的定义植物细胞培养（Plantcellculture）是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料，也可以作为基础研究的材料。同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术。什么是植物细胞培养?与组织培养的区别?

植物细胞培养(plantcellculture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议：

组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。

细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。植物组织培养⑴培养对象植物的各种组织、器官⑵培养目的获得所需的植物组织和再生植株；快速繁殖。细胞培养⑴培养对象各种形式的植物细胞⑵培养目的获得所需的细胞和各种所需的产物；进行生物转化；将外源底物转化为所需的产物。与植物组织培养的区别

二植物细胞特点问题1：与微生物相比，植物细胞有什么特点？细菌，真菌、植物细胞都有细胞壁细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞核。植物细胞比微生物细胞大。植物细胞直径一般约为10-200μm，平均直径比微生物细胞大30-100倍。植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月。植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。三植物细胞培养历史20世纪50年代，泰尔克（Talecke）和尼克尔（Nickell）证实植物细胞可生长在悬浮培养液中。随后，人们发现离体培养的植物细胞具有合成代谢产物的能力。1956年，尼克尔（Nickell）和卢荻（Routin）申请了第一个用植物细胞培养生产化学物质的专利。20世纪80年代后期，紫草宁等细胞培养生产次获得了产业化（紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药）。四植物细胞培养技术（一）培养基植物细胞培养的培养基主要由碳源、氮源、无机盐、维生素、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。目前应用广泛的基础培养基有MS、B5、N6等，具体内容参见附录。问题2：植物组织培养的培养基组成有哪些？无机盐：大量元素N\S\P\K\Ca\Mg等、微量元素有机物：糖类、氨基酸、维生素等调节物质：激素与微生物培养基相比：需要大量无机盐；多种维生素和激素；一般采用无机氮源；一般以蔗糖为碳源。生物酶悬浮分散、离心植物组织植物细胞

（二）植物单细胞分离与初步培养植物细胞培养首先需要从植物样品制备单细胞问题3：植物组织培养、细胞融合时单个植物细胞是如何获得的？1.酶解法选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质（纤维素、果胶、多糖）降解，从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等。（1）酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞。加酶过滤、离心（2）机械法第一种方法：用刀片刮叶片撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。3.愈伤组织法通过培养植物外植体诱导产生愈伤组织，并使其大量增殖，再通过机械震荡或者酶解的方法使细胞分离从而获得游离的细胞。扩增培养、液体悬浮

植物细胞

诱导脱分化外植体建立悬浮细胞培养系愈伤组织法

2.单细胞培养技术

1）平板培养法

指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。此法是Bergman(贝格曼，1960)首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株和筛选突变体。细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。主要技术要点：

单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。

单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml。

植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或封口膜将培养皿封严以防污染，在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的细胞团。平板培养法平板培养法看护培养（nursingculture）用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。这块愈伤组织被称为看护组织。由缪尔（Muir）于1953年创立。具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是：简便、成功率高。缺点是不能在显微镜下直接观察。2）看护培养与饲养层培养法饲养层培养（Feederlayerculture）把处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。微室培养

概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。1滴含单细胞培养液周围加石蜡油凹穴载玻片旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图置培养皿中26~28℃恒温培养微室培养要求：

微室内不能有气泡。

微室的厚度最好不要超过20微米，盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm左右。

观察时要保持温度和培养时一致。

3）液体浅层静置培养法

指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。该方法优点：易于补加新鲜培养基，便于镜检。（三）继代培养1.固体培养平板培养法是经常采用的一种固体培养方式，将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基（含琼脂Agar）的培养皿内进行培养。类似于微生物细胞的平板培养，具体步骤包括：单细胞悬浮液的制备、计数、调节细胞密度、培养基选择、浇平板、接种培养。采用液体培养基进行细胞培2.液体培养养。（四）植物细胞悬浮培养细胞悬浮培养（Cellsuspensionculture）是将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态的培养方式。植物细胞悬浮培养主要在摇床和生物反应器中进行，培养方法与微生物类似。优点：1.可以增加细胞与培养液的接触，促进营养的吸收。2.保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果。3.可以达到较高的细胞浓度，容易放大培养。振荡培养箱悬浮培养的生物反应器一般所说的生物反应器是指细胞培养生物反应器，是为细胞生长提供合适的化学与物理环境并能检测控制细胞生长的装置。一般都有三部分组成：反应罐、控制系统、检测分析系统。问题4.与传统微生物发酵罐相比，植物细胞培养的生物反应器有什么特点？植物细胞培养的特殊要求植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，植物细胞较微生物细胞大，对剪切力耐受性差，而且对氧的要求相对微生物要低得多，因此微生物反应器并不完全适合于植物细胞生长与生产。植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，而这些天然产物均为细胞次生代谢物。所以，植物细胞培养反应器的设计，不仅要考虑有利于细胞生长，同时还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上讲，适合植物细胞的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。光照的提供：外光源、内光源，透明材料。结构尽量简单。机械搅拌式生物反应器（Stirredtankrioreactor）一般由罐体、搅拌桨、控温系统、气路、传感器等组成。依靠搅拌器使液体产生轴向流动和径向流动。该生物反应器的优点是搅拌充分，供氧能力和混合效果较好。搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，直接影响细胞的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。需要对搅拌罐进行改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。不同叶轮产生剪切力大小顺序为：涡轮状叶轮＞平叶轮＞折叶浆＞螺旋状叶轮Kaman等采用带有1个双螺旋带状叶轮(helicalribbonimpeller)和3个表面挡板的搅拌罐，证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养。离心桨生物反应器采用三叶螺旋桨，同时采用微孔金属丝网作为空气分布器，能提供良好的混合状态，具有比机械搅拌桨底的剪切力。气升式生物反应器(Air-liftbioreactor)由气升室、气降室、除气室和底部四部分组成。培养液循环的动力来自于气升室、气降室中因含气量不同而在底部产生的压力差，因而比鼓泡型有更均一的流动形式。根据反应器内部结构与气体分布器的位置不同可分为内环流和外环流两种鼓泡式生物反应器(Bubblecolumnbioreactor)又称为鼓泡塔式反应器，是最简单的气动式生物反应器。气体分布器一般位于底部中央，气体从底部通过喷嘴或孔盘进入反应器。它不含转动部分，整个系统密闭，易于无菌操作。不同于气升式生物反应器，液体在反应器内部呈无规律的湍流状态。培养过程中没有机械能消耗，适合于培养对剪切力敏感的细胞。然而对高密度及粘度较大的培养物，反应器的混合效率会降低。其它类型生物反应器转鼓式生物反应器(Rotatingdrumbioreactor)因为转子的转动带动培养罐转动，促进了气体交换与营养物质的吸收，具有悬浮系统均一、低剪切力、防止细胞粘附在壁上的优点，适合于高密度植物悬浮细胞的培养，已用于长春花、紫草的细胞悬浮培养。（五）植物细胞固定化培养问题5：植物细胞固定化培养有什么优点？细胞固定化培养（Cellimmobilizationculture）是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一门技术。是在20世纪70年代的酶固定化催化技术基础上发展起来的。1979年，布洛德利斯（Brodelius）首次成功利用固定化的毛地黄、长春花细胞制备次级代谢产物。1.细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小，维持了细胞的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采用传统生物反应器大规模培养。2.悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加引起传质困难。固定化细胞培养系统中细胞密度远高于悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传质。3.大多数植物次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分成两个阶段。与细胞悬浮培养相比，植物细胞固定化培养具有以下优点：4.细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累。5.固定化增加了细胞与细胞间的接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物的合成。6.固定化细胞可以反复使用，可以方便地进行产物的连续性收获，降低了成本。1.固定化方法吸附、交联、共价结合、包埋等。（1）吸附固定法通过物理吸附、离子吸附（依靠静电引力固着在带有异电荷的载体上）等方法使细胞固定在载体上。（2）共价结合法细胞表面的基团（如氨基、巯基、咪唑基、酚羟基等）和固相支持物表面的基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。A将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞。优点：