第6章 基因表达的调控

RegulationofGeneExpression第六章基因表达的调控Chapter6Theone-dimensionalgeneticinformationDNAmRNAAUGpolypeptideProtein

Thethree-dimensionalinformationButnotallgenesareexpressedinallcellsallthetimeOneofthebeststrategiesforanorganism’ssurvivalistobeabletoadaptquicklytochangesinitsenvironment.Infact,afundamentalpropertyoflivingcellsistheirabilitytoturntheirgenesonandoffinresponsetoextracellularsignals.生物生存的最好策略之一就是能够尽快适应变化了的环境。事实上，依据胞外信号打开或关闭基因表达，是活细胞具有的基本特性。Thiscontrolofgeneexpressionmakesitpossibleforcellstoproducespecifickindsofproteinswhenandwheretheyareneeded.控制基因的表达，可以使细胞在一定的时空条件下，产生其所需的一组特定蛋白质。DifferentialGeneExpression基因的差异表达E.coligenome4.6106bp,4288ORF.DetailanalysisofproteininE.colihasshownthatformorethan107polypeptidechainspercell,theneachpolypeptidechainshouldhad2300copiespercell.Someproteinsmaybepresentinasfewas5-10moleculespercell,whereasothers,suchasribosomalproteinsandthemanyproteinsinvolvedintheglycolyticpathway,are

presentinasmanyas100,000copiespercell.在每个细胞中，有些蛋白质仅有5-10个分子拷贝，而另一些蛋白质如核糖体蛋白以及许多参与糖代谢的蛋白质却高达10万个分子拷贝。Ineukaryotes,essentiallyallthecellscontainthesamegenes,butthesetofgenesexpressedinformingonecelltypeisdifferentfromthatexpressedinforminganother.真核生物的所有细胞都含有相同的基因，但在一种类型细胞中表达的一套基因与另一种类型细胞中表达的基因是不同。Obviously,geneexpressioncanberegulatedbycontrollingthesynthesisofmRNAorprotein.Regulationofgeneexpressionmakescellularadaptation,variation,differentiation,anddevelopmentpossible.阐明的科学问题真核与原核生物如何调控数以千、万计的基因以最为经济、有效的时空模式进行转录，从而实现对环境的适应、细胞的分化,组织的特化，形态的发生和个体的发育。Howisgeneticexpressionregulated?基因表达的时间特异性（temporalspecificity）:是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生，以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。又称为阶段特异性。基因表达的空间特异性（spatialspecificity）:是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达的细胞或组织器官不同，从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官。故又称为细胞特异性或组织特异性。6.1原核生物与真核生物基因在表达调控机制

具有惊人的相似性共同的起源与共同的分子基础调控机理上调控层次上InteractionbetweennucleicacidsInteractionbetweennucleicacidsandprotein.Interactionbetweenproteins.transcriptionallevelPost-transcriptionalleveltranslationallevelPost-translationallevel结构改变紧密的DNA松弛的DNAAAAn转录mRNA加工RNA稳定翻译翻译基础上进行修饰修饰的蛋白质（有活性）加工后的mRNA蛋白质（无活性）前体mRNAGeneExpressionisregulationatanumberofdistinctlevelsRNAtranscription:on/off、amount、processing（加工）.ProteinTranslation:rate、amount、processing、degradation.MannerofGeneticexpression

Transcripome

isthecompletesetofgenesexpressedunderparticularconditionsinacell,tissue,ororganism.转录组：是一个细胞、组织或有机体在特定条件下表达的一组完整的基因。constitutiveexpressionLuxurygenes奢侈基因是在特定细胞中大量合成有特殊功能的蛋白质.Housekeepinggenes

（Constitutivegenes)持家基因（组成型基因）：在所有细胞中都表达，它们提供所有的细胞生长所需的基本物质.inducibleexpression6.2转录水平上的调控是最为经济、灵活，

又是最为重要、复杂的调控

在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点；

精细调节基因表达的水平,以保证生物体对环境的适应；cis-element&trans-factor间严格而灵活的互作；

保证RNApol的进行性转录（不中断，准确终止）；6.3原核生物基因表达调控的理论与模式LacoperonrepressorproteinbindingtoDNA6.3.1transcriptionallevelcontrolOperon（操纵子）

stringentresponse（应急反应）

Attenuator（弱化子）

Transposon（转座子）原核生物的基因表达调控经常发生在转录水平，尤其表现在转录的起始上。Inbacterialsystem,whenseveralenzymesactinsequenceinasinglemetabolicpathway,usuallyeitherallornoneoftheseenzymesareproduced.在细菌系统中，顺次参与同一代谢途径的酶通常会同时在细胞中合成。Thephenomenon,coordinateregulation,resultsfromcontrolofthesynthesisofasinglepolycistronicmRNAmoleculethatencodesallofthegeneproducts.

这种现象称为协同调节。是通过控制能够编码所有基因产物的多顺反子mRNA的分子合成的结果。大肠杆菌乳糖操纵子

IPOZYA调控基因启动子操纵基因半乳糖苷酶半乳糖通透酶转乙酰基酶

Operonisaunitofbacterialgeneexpressionandregulation,includingstructuralgenesand

cis-actingcontrolelementsinDNArecognizedbyregulatorgeneproduct(s).操纵子是细菌基因表达调控的单元，包括结构基因以及能够被调节基因产物所识别的存在于DNA分子上的顺式作用元件。FrancoisJacobJacquesMonodOperoncontrol

(1961Jacob&Monod，PhysiologyorMedicine1965)

操纵子调控模型：控制某一代谢途径的相关基因,紧密连锁地排列在一起,受同一操纵子控制。PromoterOperator

cis-actingregulatoryelements反式作用调节因子的基因有自己的启动子和终止子

各结构基因按一定比例协调翻译(Z:Y:A=5:2:1);

具有极性突变效应(polarity)：位于前面的结构基因发生突变，导致翻译终止，使多顺反子中突变位点下游的基因不表达。

P&O基因（cis）紧密连锁或彼此重叠，I基因（trans）位点不固定。PlacI+lacI+lacZ+lacY+lacA+terminatorPlac+lacO+

结构基因簇被协同调控;operoncontroltype：Negative&PositiveNeg.Pos.

I-

or不加入I基因产物

operonon

I+

or加入I基因产物

operonoffI-or不加入I基因产物

operonoffI+

or加入I基因产物

operonon抑制蛋白NegativePositive诱导蛋白I

gene●RepressorbindingonOsite●Operonoff●Negativecontrol是广泛保险的机制（自然选择使Prok.获得选择优势）Positivecontrol是灵活、严格、经济的调控机制ApoinducerbindingfrontPsite

意味转录效率极低阻止转录启动激活转录启动Model：模型●

两种模型都需要信号分子的参与：Addsignalmol.

OperononAddsignalmol.

OperonoffCo-repressor（辅阻遏物）Inducer（诱导物）(inducibleoperon)(repressibleoperon)原核基因调控机制的类型和特点基因表达的调控主要发生在转录水平上，根据调控机制不同，可以分为负调控和正调控。在负调控中，调节基因产物是阻遏蛋白，起阻止结构基因转录的作用。根据其作用特征又可以分为负控诱导和负控阻遏两大类。在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时结构基因不转录。阻遏蛋白作用的部位是操纵区。在正调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白。可以根据激活蛋白的性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。正控诱导系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于活性状态；正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。NegativecontrolInactiverepressor

InductionandrepressioncanbeunderpositiveornegativecontrolRepressorInducerInductionCorepressorActiverepressor

Inactiverepressor

RepressionPositivecontrolInactiveactivator

InducerActiveactivator

Activeactivator

Inactiveactivator

Corepressor没有调节蛋白时操纵元内结构基因是表达的，而加入调节蛋白后结构基因的表达活性被关闭，这种调节称为负调节。Negativeregulation：arepressorproteinbindstoanoperatortopreventagenefrombeingexpressed.负调控：阻遏蛋白结合在操作子位点，阻止基因的表达。3’5’阻遏物阻止RNA聚合酶起始转录GeneturnedonbecauseRNApolymeraseinitiatestranscriptionatpromoter当阻遏物结合到操纵子处，基因的表达关闭3’5’StructuralgenePromoterPositiveregulation：atranscriptionfactorisrequiredtobindatthepromoterinordertoenableRNApolymerasetoinitiatetranscription.正调控：转录因子结合在启动子位点，是RNA聚合酶能够起始转录所需要的。没有调节蛋白时操纵元内结构基因的转录活性是关闭的，而加入调节蛋白后结构基因转录活性被开启，这种调节方式称为正调节。3’5’TranscriptionfactorsassistRNApolymeraseGeneturnedonbyactivatorsStructuralgeneGeneturnedoffbydefaultStartpointStructuralgenePromoter3’5’Repressor:isaproteinthatinhibitsexpressionofagene.ItmayacttopreventtranscriptionbybindingtoanoperatorsiteinDNA,ortopreventtranslationbybindingtoRNA.阻遏蛋白：抑制基因表达的蛋白质，通过结合在DNA的操纵子位点上而阻止转录；或结合在RNA分子上而阻止翻译。Apoinducer:

isrequiredforRNApolymerasetoinitiatetranscriptionatspecific

promoter,butisnotitselfpartoftheenzyme.诱导物：是RNA聚合酶在特定起始子位点起始转录所必需的，但无辅基诱导蛋白本身并不是聚合酶的组成组分。Induction

referstoswitchingontranscriptionasaresultofinteractionoftheinducerwiththeregulatorprotein.诱导：通过诱导分子与调节蛋白的相互作用而起始转录的过程。Repression

referstoinhibitionoftranscription(ortranslation)bybindingofrepressorproteintoaspecificsiteonDNA(ormRNA)byinteractionofthe

corepressor.阻遏：通过与辅阻遏分子的相互作用，而使阻遏蛋白结合在DNA（或RNA）特定位点上的从而阻止转录（或翻译）的起始。Inducerisasmallsignalmoleculethattriggersgenetranscriptionbybindingtoaregulatorprotein.诱导物是通过与调节蛋白结合而触发基因转录的小分子。Corepressorisasmallmoleculethattriggersrepressionoftranscriptionbybindingtoaregulatorprotein.

辅阻遏物是通过与调节蛋白结合而抑制基因转录的小分子。P218降解物对基因活性的影响在有葡萄糖的时候，即使细菌的培养基中有乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等诱导物，相对应的操纵子也不会开启，不会产生出相对应的酶类，这叫葡萄糖效应或降解物抑制作用。因为有葡萄糖的存在，细菌所需要的能量能够从葡萄糖得到满足，它是最方便的能源，无需开动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。

6.3.1.1乳糖操纵子和负控诱导系统大肠杆菌的乳糖操纵子（lactoseoperon）包括三个结构基因Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录时，RNA聚合酶首先与启动区P结合，通过操纵区O向右转录。转录产物的每一条mRNA上都有这三个基因。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。0246810Bacterialdensity(cells/mL)Time(h)LactoseE.coliE.coliGlucoseNegative—inducibleoperon

（lactoseoperon）GlucoseusedLactoseused酶可以形成的原因是编码它们的基因在有相应糖类物质存在时可以被活跃转录。如果没有糖类的出现这些基因是不转录的。换句话说，这些基因是被调节的基因，只在特定的阶段产生它们的产物。β-Galactosidase

β－半乳糖苷酶β-Galactosidepermease

β－半乳糖苷透性酶β-Galactosidetransacetylase

β

－半乳糖苷乙酰基转移酶lacIPromoterOperatorlacZlacYlacA

Repressor38kd/monomer如果乳糖操纵子是被抑制的，没有透性酶将乳糖带到细胞中，没有β－半乳糖苷酶催化反应的发生，乳糖是如何代谢生成异乳糖的？异乳糖OOHOHOHCH2OHOOHOCH2OHOHOHOOHOHOHCH2OHOOCH2OHOHOHOHOHlactose

β-galactosidase

Whatisthenatureofthisinducer?

Whentranscriptionisinthe“off”state,abasallevelofgeneexpressionnearlyalwaysremains,oftenaveragingonetranscriptionaleventorfewerpercellgeneration;hence“off”reallymeansthatthereisverylittlesynthesisofthegeneproduct.当转录处于关闭状态时，几乎总是保持一个本底水平的基因表达，在每个细胞世代中，通常只有一个或少数几个转录事件的发生；因此，关闭的真正含义是指有较少基因产物的合成。换句话说，如果操纵子处于被抑制状态，诱导物是如何进入到细胞中去起始诱导过程的？?Thebasalleveloftranscriptionofageneisthelevelthatoccursintheabsenceofanyspecificactivation.一个基因的本底水平的表达是指在没有任何特殊激活物存在时的表达水平someinducerentersanywayviaanotheruptakesystem.总会有一些诱导物可通过其他途径被摄入到细胞内SnowballrollingOnlyabout10tetramersofrepressorarepresentpercell.由于每个细胞中大概有10个四聚体抑制物的存在，因此不需要太多的诱导物就可以启动乳糖操纵元的表达。Moreandmoreoperonproductsareavailabletoproducemoreandmoreinducer.随着乳糖操纵元产物的增多，会引起更多诱导物的形成，就像滚雪球一样。

024681012minInducedlevelBasallevelBasallevelAddinducerRemoveinducerLeveloflacmRNALevelofβ-galactosidaseBasallevelInducedlevelLagLac基因的转录调控对于诱导物的应答非常迅速，当诱导物不存在时，操纵元以极低的本地水平表达。诱导物的加入会立即激活转录，此时lacmRNA的数量迅速增加至诱导水平，从而达到mRNA合成与降解的平衡。lacmRNA翻译产生β-半乳糖苷酶。第一个酶分子的出现稍微落后于lacmRNA的出现。在mRNA和蛋白质达到最高水平之间也存在同样的延迟。当诱导物一旦除去，酶的合成立即停止，但β-半乳糖苷酶在细胞中比mRNA更为稳定，所以酶活性可保持在诱导水平时间较长.

IPTG

（异丙基硫代半乳糖苷）极强的诱导剂%InputDNA-boundCohn.JournalofMolecularBiology,Vol.34:366.1968Repressor(µg/ml)102030400.10.20.30.4-IPTG+IPTGbindingbetweenlabeledlacO-DNAwith32pandaddedincreasingamountsoflacrepressor.IPTG;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，自己不被分解的强诱导物LacorIPTG

lactoseanalog

isinducerofLacoperonmRNAstartpointRNApolymerasebindingRepressorbinding-50-40-30-20-101102030Olac(operator)cis-actionelementunwinding阻遏?竞争?双链DNA具有回文对称性，能形成十字型的茎环结构Olac(操作子)乳糖操纵元的顺式作用元件研究发现，乳糖操纵元的操作子与启动子具有一定的重叠，那么阻遏蛋白的阻遏作用是通过与RNA聚合酶发生竞争性结合还是通过空间位阻来实现的？Olac(operator)cis-actionelementATGTTACTTACAATGA+578910111417这8个碱基每一个碱基的替换都会引起结构基因的组成型表达。TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28Protectedbyboundrepressor

嘌呤被抑制物保护以防甲基化

嘌呤的甲基化由于抑制物的结合而增强T能够与抑制物交叉结合

O+—mut.

OCoccurfrequentlyatleftsiteofaxisO+突变成OC

（操纵子组成型突变）经常发生在轴的左侧TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28ATGTTACTTACAATGA+578910111417ConstitutivemutationsOclac操纵子与抑制物的结合能力要低于野生型的操纵子与抑制物的结合力。Oc需要高浓度的抑制物存在才能够实现与操纵子的充分结合。wild-typeoperator(O+)operator-constitutivemutation(Oc)controlλФ80DNA

TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28

阻遏Olac(operator)cis-actionelementExperiment：聚合酶＋含有操纵子的DNA＋阻遏物共同培养，

＋诱导物IPTG和利福平，Result：可以发生转录Conclusion：RNA聚合酶与启动子的结合，开放的启动子复合物的形成但是由于抑制物的阻挡，不能时开放的转录起始复合物转换为延伸状态。假如阻遏物能阻止开放的启动子复合物形成，如果加入利福平会与RNA聚合酶结合，使之失去与启动子结合的能力，就不能起始转录。试验结果说明加入利福平前开放的启动子复合物已经形成，加入诱导物后解除了阻遏物的抑制作用。?TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT+10+5+1-5-10+15+20+25-7+28CompetitionOlac(operator)cis-actionelement2.302.342.382.4220004000600002.26荧光强度Time(sec)Noaddition+Heparin+RepressorNoDNARNA聚合酶，启动子和操纵子的DNA，然后研究由此复合物、加入了抑制物或加入了肝素之后引导的流产式的转录合成。通过UTP类似物（荧光标签在γ磷酸上，*pppU）检测了转录产物。如果*pppU加入到了正在合成的RNA中，标记的磷酸会脱离掉，荧光的强度会降低。聚合酶和抑制物竞争结合操纵子如果有肝素和抑制物，转录的水平会大大下降。加入肝素，它与聚合酶结合，阻止了聚合酶与DNA的结合，可以使转录产物减少。加入了低浓度的抑制物，与聚合酶竞争作用位点，在一定程度上阻止了聚合酶的移动。对照是没有DNA的试验。O和P是重叠的，抑制物和RNA聚合酶的结合位点在操纵子的起始位点附近重叠。repressor&RNApolymerase对重叠位点竞争以上试验证明竞争的假设是正确的O+—mut.

OCoccurfrequentlyatleftsiteofaxisRepressor对重叠位点的竞争力下降有利于RNApolymerase的结合---调控机理Inducer(Alloactose)

与repressor

特异结合tetramer变构

特异结合力下降1000X作用于O

位点上的repressor

变构

脱离O位作用于游离的repressoroperononrepessortetramer与operator发生特异结合

operonoff

变构

失去结合于O位的能力操纵子上的基因在翻译的时候，核糖体沿着多顺反子移动，在翻译完上一个基因编码的蛋白质后，核糖体解离，小亚基不立即从mRNA上解离而是继续沿着mRNA移动，直到遇到下一个基因的起始密码，核糖体重新聚合，翻译下一个蛋白质。lac操纵子的本底水平表达在没有诱导物存在时，也能够合成透过酶，才能够把第一个诱导物从细胞膜外运送到细胞膜内发挥其功能。乳糖不与阻遏物结合，真正的与之结合的是乳糖的异构体——异构乳糖，是在β-半乳糖苷酶的催化下形成的。所以这同样需要在非诱导状态下有少量的lacmRNA的合成，这种合成称为本底水平的组成型合成。由于阻遏物与操纵区的结合不是非常紧密的，偶尔也会从操纵区上掉下来，这样就可以开始mRNA的合成。lacI基因产物及功能阻遏物lacI基因的产物是由弱启动子诱导的组成型表达的。阻遏蛋白由四个相同的亚基组成。能够与IPTG结合。当I基因的弱启动子变为强启动子时，细胞内不能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个操纵子在突变体中不可诱导。大肠杆菌对乳糖的反应在以甘油为碳源的培养基中，lac操纵子的本底表达使每个细胞中有1-2个两类的酶分子存在。加入乳糖，乳糖分子可以进入细胞内变构形成异构乳糖，与阻遏物结合导致lacmRNA的表达，产生出大量的酶分子，酶分子继续作用于培养基中的乳糖，促进了此类循环。当培养基中的乳糖消耗完后，阻遏物的合成继续进行，导致操纵子的mRNA的合成被阻止。葡萄糖对lac操纵子的影响如果将葡萄糖和乳糖同时加入到培养基中，大肠杆菌在消耗完葡萄糖之前是不会利用乳糖的。葡萄糖对lac操纵子的抑制是间接的。例如一个大肠杆菌突变体，它在糖酵解途径中不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一个代谢中间产物，这个细菌中在有葡萄糖存在时也可以诱导lacmRNA的表达。说明不是葡萄糖而是它的某些代谢产物抑制了lacmRNA的合成。将葡萄糖的这种效应称为分解代谢物阻遏效应。lac操纵子中的其他问题A基因的生理功能：抑制β-半乳糖苷酶产物的有害性衍生物在细胞内的积累，对生物的进化有积极作用。Lac基因产物数量上的比较：三个基因的酶分子的拷贝数比例是1：0.5：0.2。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节的结果。操纵子的融合与基因工程：lac启动子是一个很强的启动子，通过它可以使弱启动子的转录增强。从而增加蛋白质的合成量。此技术经常应用于基因工程中。操纵子突变P221操纵基因突变和顺式显性最早通过组成型突变鉴定了操纵基因，这种突变被称为Oc，是一种组成型突变。与发生Oc突变相邻的结构基因呈组成型表达，其机制是突变使操纵基因改变，不再与阻抑蛋白结合，因此阻抑蛋白不能阻止RNA聚合酶起始转录，于是操纵子持续不断地表达。操纵基因控制着邻近的基因，而对细胞内存在的其他等位基因无作用。此位点的突变，如Oc突变称为顺式显性(cis-dominance)突变。顺式显性突变的概念适用于其功能是被识别而不是转换成可扩散性产物的任何DNA序列的突变。因此，顺式显性突变属于顺式作用位点突变。乳糖操纵子突变类型调控基因（I）mutant突变发生在阻遏蛋白的DNA结合位点

表达产物失去与O的结合能力突变发生在阻遏蛋白与效应物结合位点

表达产物失去与效应物的结合能力operonon

Icoperonoff

Is操纵基因（O）mutantOc

操纵基因突变使起不再与阻遏蛋白结合operonon

Oc乳糖操纵子突变类型调控基因（I）mutant突变发生在阻遏蛋白的DNA结合位点

表达产物失去与O的结合能力operonon

Ic操纵基因（O）mutantOc

操纵基因突变使起不再与阻遏蛋白结合operonon

OcIcZ+/I+Z+OcZ+/O+Z+operonoffIc对I+表现为隐性operononOc对O+表现为显性操纵子不可诱导型突变操纵子不可诱导型突变在遗传学上可分成两类。每一类的显性关系都能用于确定基因座的性质。启动子突变是顺式作用。如果突变使得RNA聚合酶不能与Plac结合，就会使操纵子不能转录而丧失功能。阻抑蛋白失去结合诱导物能力的突变被称为lacIs（超阻型突变）。在这种突变中，由于阻抑蛋白上诱导物的结合位点缺失，加入诱导物也不起作用，所以不可能将阻抑蛋白转变成非活性形式。Positive—inducibleoperon(多为分解酶类)PositivecontrolInactiveactivator

InducerActiveactivator

cAMPcontrol(普遍调控系统

)p224LacoperonopenbutnotranscriptsGlucoseLactoseE.coliWhy?葡萄糖缺乏时葡萄糖充足时葡萄糖充足时cAMP水平很低，且cAMP很少与CAP结合1葡萄糖含量低时cAMP水平很高1CAP很容易结合cAMP，形成复合物结合DNA2增加聚合酶结合的效率3RNA聚合酶无法高效地结合到DNA上2cAMPcAMPcAMPcAMPplacICAPcAMPCAPCAPcAMP转录并翻译透性酶β半乳糖苷酶转乙酰酶乳糖葡萄糖半乳糖cAMPcAMPplacICAPCAP低水平转录结构基因高效率的转录和翻译4××ATPpppcAcAMPpcA5’-AMPpcAI(capgene)(cAMP受体蛋白或代谢物基因激活蛋白)p224cAMPase(-)磷酸二酯酶(+)+GlucoseLacOperonIPO

在转录一章我们了解到，RNA聚合酶起始转录需要CAP-cAMP与RNA聚合酶的CTP相互作用才能有效起始转录。而细胞内cAMP的浓度恰好受到葡萄糖代谢产物的影响。其具体机制如下：葡萄糖的代谢产物会抑制细胞内腺苷酸环化酶活性，同时激活磷酸二酯酶的活性，而者共同作用的结果是导致细胞内cAMP的浓度很低，不足以活化CAP。这样即使异乳糖使阻遏蛋白失活，从操作子上脱离下来，无CAP-cAMP的辅助，结合在启动子上的RNA聚合酶也不能启动转录。因此葡萄糖效应又称代谢阻遏。CAP和cAMP促进了开放的启动子复合物的形成Lac的调控区：在操纵子的上游启动子的左侧含有激活位点，也叫CAP结合位点Upelement提高ARⅡ的结合效率CAP-cAMPbindingsite(Activatorregion，AR)IR-60

ARⅠ

-40ARⅡ

-50-30-20-10+1-70IRInvertedrepeat（反向重复）ARⅠ是CAP-cAMP的强结合位点（-70~-50）

ARⅡ是CAP-cAMP的弱结合位点（-50~-40）

ARⅠ+CAP-cAMPcooperativeeffect

RNApol

ARII+CAP-cAMP复合体

促使SextamaBox附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，

PribnowBox的解链温度降低，利于转录启动ARIARIIGCIslandSextamaPribnowNullARII

RNApol.intopribnowBox

BUTtranscriptionoff转录关闭RNApolRNApolTheCAP-cAMPcomplexstimulatestranscriptionofLacoperonbybindingtoanactivatorsiteadjacenttothepromoterandhelpingRNApolymerasebindtothepromoterCAP-cAMP复合物通过与启动子相邻的激活位点的结合并有助于RNA聚合酶与启动子的结合，从而促进乳糖操纵元的转录。CAP-cAMP

通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用与RNA聚合酶的αCTD末端相互作用。CAP-cAMP结合在靶DNA上时使DNA大概弯曲100°。CAP-cAMP二聚体结合到DNA上的激活物结合位点上，RNA聚合酶的α亚基的CTD与CAP蛋白上的特殊位点相互作用，增强了聚合酶和启动子的结合。RNA聚合酶在CAP的协助下结合到启动子上，CAP由α-CTD（C端结构域）识别。CAP-cAMP激活乳糖操纵子的假说

Busby,S.andR.H.EbrightCell79:742,1994cAMP与代谢物激活蛋白在大肠杆菌中，cAMP的浓度受到葡萄糖代谢的调节。如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中培养，细胞内cAMP的浓度就高。如果在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度也会很高。因此推测糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间的某些代谢产物是腺苷酸环化酶的抑制剂。CAP因子是由两个相同的亚基构成的二聚体。明显特点是不同操纵子CAP结合位点与转录起点的相对位置不同。结合位点位于启动子内（-41bp），只有一个CAP与DNA结合，并与RNA聚合酶紧密接触。Gal操纵子。结合位点与启动子相邻（-61bp），有两个CAP与DNA结合，CAP与RNA聚合酶毗邻。Lac操纵子。结合位点位于启动子上游（-92bp），有一个CAP与DNA结合，CAP与RNA聚合酶之间有另一个调控蛋白结合。Ara操纵子。理论上CAP激活转录有两种作用方式：直接作用于RNA聚合酶。作用于DNA并改变其结构，以协助RNA聚合酶的结合。cAMP—CAP具有广泛生理效应的正控制系统存在于多种基因表达调控体系中LacoperonexpressioncAMP(Positive-inducible)

正控诱导lactose(Negative-inducible)

负控诱导

Negative—repressibleoperon(Anabolicenzyme)（Operonstendtobeturnedonbythepresenceofthatsubstance）前面我们介绍的乳糖操纵元是可诱导的负调控，当底物的出现操纵元才具有转录活性，编码的蛋白质是参与分解底物的酶。（Negative—repressibleoperon(Anabolicenzyme)）大肠杆菌基因组还具有可阻遏的负调控操纵元，主要是编码参与合成代谢的酶类的基因。（Operonstendtobeturnedoffbythepresenceofthatsubstance）由于底物的存在，操纵元是关闭的，因为培养基中含有这种营养物质，生物体没必要再消耗原材料和能量自己合成这种营养物质。（e.g.tryptophansynthetaseoperon）如大肠杆菌的色氨酸合成酶操纵元。（Igene

inactiverepressor）其调节基因编码的阻遏物是无活性的，只有当辅阻遏物（色氨酸）存在时，操纵元才被关闭（Co-repressor(tryptophan)。6.3.1.2色氨酸操纵子与负调控阻遏系统它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。操纵子除了具有阻遏系统以外还有弱化系统。NegativecontrolInactiverepressor

InductionandrepressioncanbeunderpositiveornegativecontrolRepressorInducerInductionCorepressorActiverepressor

Inactiverepressor

RepressionPositivecontrolInactiveactivator

InducerActiveactivator

Activeactivator

Inactiveactivator

Corepressor

Negative—repressibleoperon(Anabolicenzyme)e.g.1tryptophansynthetaseoperon（色氨酸合成操纵子）Igene

inactiverepressor（无活性的阻遏物）Co-repressor(tryptophan，色氨酸)底物的出现操纵子打开；由于信号分子（辅阻遏物）的出现操纵子关闭Ptrp+trpEtrpDtrpCOtrptrpLAttenuatortrpBtrpAtrpRLeaderregiontrpE：邻氨基苯甲酸合成酶亚基ⅠtrpD：邻氨基苯甲酸合成酶亚基ⅡtrpC：邻氨基苯甲酸异构酶;吲哚甘油磷酸合成酶trpB：色氨酸合成酶β亚基trpA：色氨酸合成酶α亚基trpR：产生阻遏物的基因,AporepressormonomertrpL：前导肽色氨酸的合成分五步完成，共有7个基因参与。培养基中色氨酸含量高时，与游离的辅阻遏蛋白结合，并使之与操纵区DNA紧密结合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，操纵子去阻遏。细菌中参与分枝酸代谢的主要酶系大肠杆菌中的trp操纵子1.邻氨基苯甲酸合酶（包括ADIC合酶合ADIC裂解酶）；2.ADC合酶，ADC裂解酶；3.异构分枝酸合酶；4.分枝酸裂解酶trpR基因产物被称为阻遏物蛋白前体，无活性。该基因的突变常常引起trpmRNA的组成型表达。此系统中的效应物分子是色氨酸。除非培养基中有色氨酸，否则这个阻遏蛋白不会与操纵区结合。阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，才会与操纵区结合，从而关闭trpmRNA的转录。当培养基中的色氨酸含量较高时，与游离的辅阻遏蛋白结合，并使之与操纵区的DNA紧密结合；当培养基中的色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，色氨酸操纵子去阻遏。OperatoroperononoperonoffRepressor+trpactiverepressorInactiverepressorPtrp+trpEtrpDtrpCOtrptrpBtrpAtrpRPtrp+trpEtrpDtrpCOtrptrpBtrpAtrpRtryptophanRepressor(inactive)cannotbindontheOsite(trpabsent)discovery●

E.colitrpsynthetaseoperon(

C.YanofskystanfordUniv.)Negative-repressibleoperon负阻遏操纵子与完全没有阻遏物时相比，可以使阻遏的效率上升70倍。IPOleadingseq.EDCBAtrp+●1968.ImamatoLab.当trp水平较低时，RNApol移动但是在L.S.处脱落，结构基因停止转录。IPOleadingseq.EDCBALowtrp+thecomplexcannotbindwiththeOsite●1975ImamatoLab.E.colitrp-AARS(t.s，温度敏感型突变体，42℃不能负载色氨酸)w.t.30℃trpEt.s.mut.42℃trpELowtrp，operonopen培养在Trp含量低的培养基上检测操纵子中trpE的表达活性TrptRNAtrp30℃42℃t.s.(42℃)t.s.(30℃)w.t.(30℃)

w.t.(42℃)trpEWhy?AARS

t.s.(42℃)AARSinactive

notrp-tRNAtrpsynthesis

RNApolmovepastL.S

transcriptoftrpE(Eenzymelevelishigh）

t.s.(30℃),w.t.(30℃),(42℃)AARSactivesynthesizetrp-tRNAtrpRNApolbreakoffatL.S.notranscriptionoftrpE

（Eenzymelevelislow）Conclusion:---Whentrpand/ortrp-tRNAtrp

existincells,thereisnosynthesisoftrp---t.s.(42℃)noAARSandtrp-tRNAtrp,（initiatethetranscriptionoftrpsynthetaseRNA)---trp-tRNAtrp

isthemainfactorleadingtoRNApol.falling

offatL.S.TheprimarystructureoftrpoperonRNA在trpmRNA5’端trpE基因的起始密码前有一个长162bP的mRNA片段被称为前导区。其中123-150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。研究发现，当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，这就是123-150区序列缺失会提高trp基因表达的原因。在trpmRNA5’端trpE基因的起始密码前有一个长162bP的mRNA片段被称为前导区，其中123-150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。研究发现，当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，这就是123-150区序列缺失会提高trp基因表达的原因。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。研究引起终止的mRNA碱基序列发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。这种调控机制就是弱化作用（attenuation）。事实上，阻遏机制对色氨酸来说是一个一级开关，主管转录是否启动，相当于trp操纵子的粗调开关。trp操纵子中的弱化子系统进行细调控，决定已经启动的转录是否继续下去。这个细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，细胞中色氨酸的浓度是实现过早终止的根本原因。TheprimarystructureoftrpoperonRNA

60~68—75~83&110~121—126~134(palindromicseq.),poly(U)27—68base

ORFof14aa140baseRNAalmostbindingwithprotein(translableseq.)trphighfrequencywith2/14in14aa前导肽弱化作用需要负载tRNAtrp参与，这说明前导序列的某些部分被翻译了。前导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA；如果翻译起始于AUG，应该产生一个含有14个氨基酸的多肽。前导序列具有一个非常有意义的特点：在第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。这一点很重要，因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有7个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有7个苯丙氨酸密码子。这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。(7/16)(7/16)(8/15)RegulatorycomponentsofthetrpLregionmRNA前导区的序列分析trp前导区的碱基序列中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。RNaseTl降解实验(此酶不能水解配对的RNA)表明，纯化的trp前导序列中确有1--2和3--4的配对方式，由此定位的3--4配对区正好位于终止子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。衰减子调控机制是控制RNA聚合酶通读衰减子的能力。通过细胞内是否存在已经负载氨基酸的氨酰tRNA，调节内部终止子发夹结构的形成。转录弱化作用转录的弱化理论认为mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对tRNAtrp的浓度敏感。当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNAtrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区(或停留在两个相邻的Trp密码子处)，这时的前导区结构是2—3配对，不形成3--4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将结构基因转录。当培养基中色氨酸的浓度很高时，核糖体可以顺利的通过两个相邻色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样致使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎环结构状终止结构，转录停止。所以弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。Trp(Arg)starvedNon-starvedRibosomepassthrough

TrpcodonUUUUUU1234核糖体通过Trp密码子，占据1和2序列，转录形成的3和4可以形成发夹结构，阻止转录的进行，转录停止，出现弱化作用。RibosomepausingatTrpcodon1423核糖体停留在Trp密码子处，此时没有足够的Trp，核糖体停留于此，此时转录出来的2和3形成发夹结构，RNA聚合酶转录出来的4没有和3形成终止子的机会，RNA聚合酶继续向下移动，转录结构基因，此时不表现出抑制作用。tRNAtrp+AARStrptrp-tRNAtrpProteinsynthesisTrpsynthetaseopron

IPOL.SEDCBAThetrpoperonofE.coliIntryptophan-poormediumIntryptophan-richmedium细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。细菌中为什么需要有弱化子系统呢?一般认为，阻遏物从有活性向无活性的转变速度较慢，需要有一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。弱化子能较快地通过抗终止的方法来增加基因表达，迅速提高内源色氨酸浓度。那么，为什么还要有阻遏体系呢?没有阻遏体系，似乎只有弱化也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济。事实上，自然界中存在着不同类型的合成体系。组氨酸操纵子拥有在功能上与操纵子完全相同的弱化子结构，但没有阻遏物，它的表达完全受弱化子调节。6.3.1.3其他操纵子

(1)半乳糖操纵子

大肠杆菌半乳糖操纵子（galactoseoperon）包括3个结构基因,异构酶(galE)/乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)/半乳糖激酶(galk)。这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。半乳糖操纵子的调节基因是galR。galR与结构基因及操纵区O等的距离都很远，而galR产物对galO的作用与lacl-lacO的作用相同。gal操纵子的诱导物主要是半乳糖。目前为止gal阻遏蛋白的作用机理还不清楚.此外，gal操纵子还有两个特点：①它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；②它有两个O区，一个在P区上游-67—-73，另一个在结构基因galE内部。gal操纵子、lac操纵子和ara操纵子的结构及其代谢途径cAMP-CRP对gal启动子的作用

gal操纵子P-O区的碱基序列有两个相距仅为5bp的启动子，gal操纵子可以从两个启动子分别起始基因转录，每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点Sl和S2。cAMP-CRP对从S1和S2起始的转录有不同的作用。从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时才能顺利进行，RNA聚合酶与Sl的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。体外转录的实验证明，cAMP-CAP能够刺激gal操纵子从S1的转录，cAMP-CAP抑制从S2的转录。当有cAMP-CAP时，转录从S1开始，当无cAMP-CAP时，转录从S2开始。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CRP能抑制由这个启动子起始的转录，因此，cAMP-CRP在gal操纵子中所起的调节作用比在lac操纵子中更为复杂。一般认为，cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1区复合物形成开链构象，从而起始基因转录。同时，由于S1和S2区的核苷酸部分重叠，这一复合物的存在干扰了RNA聚合酶-S2复合物的形成，抑制S2起始的基因转录。双启动子的生理功能

为什么gal操纵子需要两个转录起始位点?这与半乳糖在细胞代谢中的双重功能有关。半乳糖不仅可以作为惟一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质——尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。生长过程中细胞必须随时合成相应的酶，以保证UDPgal的供应。在没有外源半乳糖的情况下，细胞通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP—葡萄糖合成UDPgal。因为合成细胞壁过程中对异构酶的需要量很小，本底水平的组成型合成就能够满足生理需要。显然此mRNA是在没有半乳糖的情况下合成的。如果只有S1一个启动子，由于这个启动子的活性依赖cAMP-CAP，当培养基中有葡萄糖时就不能合成异构酶。假如只有启动子S2，在没有葡萄糖存在有半乳糖存在时，细菌不能利用半乳糖，就算本底水平的合成也被阻遏了。所以，无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的S2启动子进行本底水平的组成型合成，以及一个依赖于cAMP-CRP的S1启动子对高水平合成进行调节。（2）阿拉伯糖操纵子阿拉伯糖(arabinose)是另一个可以为代谢提供碳源的五碳糖。在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA和araD，它们形成一个基因簇，简写为araBAD。araBAD相邻的是一个复合的启动子区域、两个操纵区（Ol，O2）和一个调节基因araC。AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。araBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。caparaIaraBaraA

araDaraO2araO1araC存在两个操作子位点araO1和araO2

Theara

Operon//阿拉伯糖操纵元第一个操纵子araO1控制调控基因araC的转录活性，第二个操纵子araO2位于其控制的基因PBAD启动子的远上游的位置TheCAP-bindingsiteisabout200bpupstreamof

arapromoter.CAP结合位点在PBAD的上游约200bp处。Theoperonhassystemofnegativeregulation,mediatedbytheAraCprotein.阿拉伯糖操纵元具有由AraC蛋白介导的负调控系统IsomerasearaA编码异构酶（Isomerase）催化L-阿拉伯糖（L-Arabinose）形成L-核酮糖（L-Ribulose）；araB编码L-核酮糖激酶（L-Ribulokinase）催化L-核酮糖（L-Ribulose）形成L-5-磷酸核酮糖（L-Ribulose-5-P）；araD编码L-5-磷酸核酮糖差向异构酶（L-Ribulose-5-Pepimerase）催化L-5-磷酸核酮糖（L-Ribulose-5-P）形成D-5-磷酸木酮糖（D-Xylulose-5-P）阿拉伯糖操纵元的调控蛋白AraC具有双重效应，即可以作为正调控蛋白又可以作为负调控蛋白，其在操纵元上具有三个结合位点：araO2,araO1,andaraI.CAPsitearaI

araB

araA

araDaraO2araO1araCPCPBADAraCL-ArabinoseL-RibuloseL-RibulokinaseL-Ribulose-5-PATPA