第10章核酸的生物合成

第十章核酸的生物合成基因(gene)：

为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。基因组（genome)：

某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。

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逆转录*中心法则(thecentraldogma)

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逆转录主要内容●

DNA的生物合成——复制

●

RNA的生物合成——转录

●

蛋白质的生物合成——翻译

●基因重组与基因工程第一节DNA的生物合成

DNABiosynthesis一、DNA的复制二、逆转录三、DNA的损伤和修复四、多聚酶链式反应（PCR）一、DNA的复制DNA分子是如何通过复制把遗传信息高度保真性地（fidelity）传递给子代细胞的？一、DNA的复制概念：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。（一）复制的基本规律1、半保留复制复制亲代DNA子代DNADNA半保留复制示意图Watson和Crick于1953年假定DNA的复制为半保留复制。

全保留式半保留式混合式DNA复制的三种可能方式1958年M.Meselson和F.M.Stall利用同位素15N标记大肠杆菌，首先证明了DNA半保留复制。15N-15N14N-14N15N-14N半保留复制的生物学意义按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin)

。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。2.有一定的复制起始点放射自显影证实亲代链解开后立即进行复制，没有发现单链DNA。细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。起点起点起点起点起点起点3、复制方式E.coil基因结构与复制起点oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)DNA的双向复制示意图DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是3'→5'。由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。4、半不连续复制3

5

3

5

3´5´3´5´解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)DNA的半不连续复制3´5´半不连续复制动画冈崎片段：

•1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。

•原核生物:1000~2000个核苷酸

•真核生物:100~200个核苷酸以3’→5’方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5’→3’，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。以5’→3’方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5’→3’，这条链被称为随从链(laggingstrand)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

（二）DNA复制的体系

底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)

聚合酶:

依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)

模板:解开成单链的DNA母链

引物:提供3'-OH末端的寡核苷酸

其他酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶复制的化学反应

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

聚合反应的特点以DNA单链为模板以dDNA为原料引物提供3′－OH聚合方向为5′→3′3´1、拓扑异构E（动画）10

8局部解链后DNA复制过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。拓扑异构酶的作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类拓扑异构E不需要能量或辅助因子如：ATP和NAD＋需要能量或辅助因子如：ATP和NAD＋拓扑异构酶Ⅰ的作用拓扑异构酶Ⅱ的作用通过催化DNA拓扑结构的变化，减少由于解链形成的张力解链双螺旋存在张力DNA拓扑异构酶Ⅱ张力解除双螺旋变成松弛状态解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。2.解旋酶3、单链DNA结合蛋白(SSB)3′5′5′5′3′SSB的作用①保护单链DNA免遭核酸的降解。防止单链再次形成双链③降低DNA的Tm，促进DNA解链。SSB4、引发酶和引发体3'HO5'3

5

3

5

引物酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶，该酶以DNA为模板，合成一段RNA引物，为DNA聚合酶提供自由的3′-OH，使子代DNA链能够开始聚合。引物引物酶

DnaADNA拓扑异构酶

DnaBDnaCSSB

DnaA

DnaBDnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

引发体的组装形成引物酶的作用：为DNA聚合酶提供自由的3′－OHRNA引物的大小，在原核生物中通常为50~100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。5、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)简称：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合酶活性

2.核酸外切酶活性大肠杆菌中至少有5种，分别命为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。①DNA聚合酶I（单体酶：单肽链）主要功能：负责DNA的损伤修复及在DNA复制中切除引物，填补空隙的作用。若用枯草杆菌蛋白酶处理此酶，可得两个片段。蛋白酶切口Klenow片段的分子结构大片段保留了两种酶活性,即5'→3'聚合酶和3'→5'外切酶活性，通常被称为Klenowfragment。5

→3

聚合酶活性5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。

DNA聚合酶的核酸外切酶活性3’→5’外切酶活力DNA聚合酶I小结②DNA聚合酶Ⅱ（单体酶）

主要功能参于DNA的损伤修复，具有5´→3´聚合活力，较弱，3´→5´外切活性。但无5´→3´外切活性。③DNA聚合酶Ⅲ（寡聚酶）

是催化大肠杆菌DNA复制的主酶，全酶有10种亚基，含Zn2+。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能

延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化原核生物DNA聚合酶－真核DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。6、DNA连接酶功能连接复制过程形成的DNA片段,形成一个3′,5′-磷酸二酯键连接酶ATGCCGPPOHAPTATGCCGPAPTP连接酶DNA连接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN++AMP）HO5’3’5’3’3’5’5’3’DNA连接酶的连接作用连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的作用DNA复制酶系总览（三）原核生物DNA复制DNA+n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTPDNA+(n1+n2+n3+n4)PPiＤＮＡ聚合酶Mg2+以四种dNTP为底物在DNA模板指令下，按碱基配对的原则，由DNA聚合酶催化，向DNA的3′－OH端添加核苷酸，以5′→3′的方向合成与模板互补的新链。1、复制的起始原核生物：特定位点开始，特定位点终止，只有一个复制子。（基因组能独立进行复制的单位）。真核生物：多个位点起始，多复制子。大肠杆菌复制起始点：oriC（original）

终止点：ter（terminate）一些特殊的Pr可以识别并结合到复制起点，随即使DNA双螺旋局部解链，形成复制眼，在其两端的DNA的两股链呈丫字状，称为复制叉。分别向两侧进行复制，通常复制叉双向等速前进，迅速生长的细菌，第一轮复制未完成就启动第二次复制。DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。

1．解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。2．引发体组装和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体；在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polDNA复制的延长过程2、DNA链的合成与延伸领头链的合成过程随从链的合成过程DNA聚合酶ⅢRNA引物领头链的合成是连续的，而随从链的合成是不连续的，为什么？复制过程简图解螺旋酶3′5′5′3′3′5′DNA拓扑异构酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ引发体连接酶DNA复制系统SSPDNA聚合酶I原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。

E.colioriter8232

ori

terSV405003、复制的终止

在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶Ⅰ（原核生物）或DNA聚合酶

（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。（1）去除引物，填补缺口：在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。（2）连接冈崎片段5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

ADP+Pi5

5

DNA连接酶随从链上不连续性片段的连接拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶Ⅱ将两个子代DNA环分离为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：

1．遵守严格的碱基配对规律；

2．DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；

3．对复制过程中出现的错误及时进行校正。DNA复制的保真性(fidelity)：DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现外切酶活性。（四）真核生物DNA复制真核细胞染色体DNA分子为线性的。比原核细胞DNA分子大，复制更为复杂。为多复制子复制（多起点双向复制），在全部染色体复制完成前，各复制子不能再开始新一轮复制。真核生物DNA复制起始复合物的组装和激活分属于不同的细胞周期。端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。真核生物端粒的形成：在DNA复制的同时另外还要组装成核小体。功能•维持染色体的稳定性•保证DNA复制的完整性端粒的结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。5

3

3

55

3

3

5端粒酶(telomera