梨品种花粉管生长特性观察

梨品种花粉管生长特性观察

授粉和提取物是开花植物具有性生殖过程的重要阶段，包括从花粉到头部的过程，花粉管进入胚囊，然后完成双重提取物和合子创造。这个过程是否成功取决于花粉和雌花之间的识别关系。通常芸薹属植物等孢子体型自交不亲和性植物的花粉不能在柱头上萌发或不能穿过柱头,而梨、苹果等蔷薇科植物是典型的配子体型自交不亲和性植物,自花或异花授粉的花粉均能在柱头上萌发、穿过柱头,但在沿花柱向子房生长途中自花授粉的花粉管将被抑制而停止生长。已有研究表明,自花花粉管在花柱内停止生长是由于花柱内自交不亲和性基因(S基因)所表达的S-RNase分解了自花花粉管RNA而抑制了花粉管生长,花粉管无法进入胚囊完成受精,而导致自花授粉不结实。许多育种专家利用蕾期授粉能够获得自花授粉的种子的方法来获取自交不亲和性植物的自交后代,也就是说,蕾期授粉能够克服一些植物的自交不亲和性,但这种蕾期授粉能结籽的原因还不太清楚,可能是由于此期S基因在雌蕊中的表达量少或不表达,使得未成熟的雌蕊人工自花授粉后可以结实(子)。一些学者还提出开花后几天的S-RNase含量下降,因而延迟授粉也表现较强的亲和性。为了进一步阐明蕾期授粉或延迟授粉能够获得自交后代的机制,我们以沙梨(Pyruspyrifolia)为试材,对不同花龄的梨花进行授粉,应用荧光显微镜观察了不同花龄花柱自花、异花授粉后花粉萌发及其在花柱内的生长动态以及花粉管自身的形态变化,并与田间授粉的结果进行了比较分析,以便从不同角度为阐明蕾期授粉能够克服自交不亲和性提供理论依据。1材料和方法1.1培养和贮藏2003年3月上旬在高邮市果树实验场品种园采集丰水和菊水含饱满花芽的健壮枝条,室内培养并催花,采集花粉,贮藏备用。另采集丰水和菊水健壮含饱满花芽的枝条,室内培养备用。1.2方法1.2.1丰水、菊水的授粉分别对开花6、4、2d前及当天即将开花(散粉前)的丰水和菊水的花蕾进行去雄,同时疏去一些生长较弱的花蕾,长度50cm左右的花枝保留花蕾约20个,然后分别进行丰水、菊水的自花及丰水×菊水的异花授粉,同时将开花当天去雄并隔离的花柱在花后2、4d进行丰水、菊水自花及丰水×菊水的异花授粉,授粉后立即套袋。授粉时间为上午9至11时,每个处理重复15朵花以上。授粉后在25℃光照培养箱中培养,分别于12、24、48、72、96h切取各处理花朵的花柱,用FAA固定液固定。花柱的压片参照Kho等的方法,同时对花柱的软化处理作一些调整,而后用荧光显微镜观察花粉在柱头上原位萌发和花粉管生长情况,每个处理重复3次。1.2.2授粉前处理及授粉2004年3月分别于南京市傅家边果林场和高邮市果树实验场进行田间授粉,授粉前处理及授粉同室内观察处理,每个处理重复200朵花,授粉后1周去袋,1个月后统计坐果率。2结果与分析2.1花粉管生长情况丰水自花授粉花粉管生长情况如表1~3所示,虽然不同时期授粉后到达花柱上部、中部和下部的花粉管数量表现为上部较多、中部较少、下部最少的梯度分布,但蕾期自花授粉和延迟自花授粉都表现一定的亲和性,以开花4d前的蕾期授粉效果最好,这一时期生长到花柱基部的花粉管数量最多,其次为开花4d后的延迟授粉,如自花授粉后96h,丰水开花当天自花授粉到达花柱基部的花粉管数为0根,而开花4d前的蕾期自花授粉平均有8.35根花粉管到达花柱基部,占花粉管总数的7.38%,开花4d后的延迟授粉有5.64根花粉管到达花柱基部,占花粉管总数的5.54%。其余的蕾期授粉和延迟授粉的亲和性较当天授粉也都有了一定的提高。开花6d前的花粉附着量比较小,约为50粒,其它花粉附着量都比较大,超过100粒,通过观察发现此时花粉量已足够引起“群体效应”。花粉管生长早期以延迟授粉和成熟花授粉花粉管生长较快,如在授粉后12h,蕾期授粉没有1根花粉管生长到柱头下1/3处,而成熟花授粉和延迟授粉都有一定量的花粉管生长到达此处,特别是丰水开花4d后的延迟自花授粉平均有70.8根花粉管生长到柱头下1/3处,并且平均有7.4根生长到花柱中部,2者分别占花粉管总数的42.5%和4.4%。蕾期授粉在后一阶段又表现较快的生长速度,如授粉后48h,开花6d前的蕾期授粉在花柱基部开始出现一定量的花粉管,平均为2.14根,到达花柱基部的花粉管数增长也较快,最后,各花龄授粉到达花柱基部所需时间差别不是很大。蕾期和延迟授粉对菊水自花授粉花粉管生长的影响与丰水类似,如表1~3和图1所示。区别主要表现在以下几个方面:首先,大多数同花龄授粉组合在相同的时间里,菊水自花授粉到达花柱基部的花粉管数较丰水多(开花6d前的蕾期授粉除外);其次,丰水表现在当天授粉亲和性最低,而菊水表现在开花2d后授粉亲和性最低,并且开花4d后的菊水自花授粉生长到花柱基部的花粉管数较授粉当天提高的不明显,仅提高3.28个百分点,即由21.44%提高到24.72%。由表1~3和图1可以看出异花授粉与自花授粉后花粉管生长情况主要存在以下差异:首先,同花龄花不同的授粉方式,在授粉后相同的时间内,到达花柱各部位的花粉管数量始终以异花授粉为最多,如图1中的B和E差别就非常明显;其次,异花授粉表现为开花前后授粉,生长到花柱中、下部的花粉管数量多,亲和性较高,而自花授粉以蕾期授粉和延迟授粉并主要以蕾期授粉生长到花柱中、下部的花粉管数量较多,表现较高的亲和性,如图1中的异花授粉中B和C,菊水自花授粉中D、E和F很好地反映了这一现象;另外,异花授粉花粉管很少出现尖端膨大和弯曲现象,自花授粉特别是丰水自花授粉有时会出现少量的尖端膨大和弯曲等变形现象(图片略)。2.2自花授粉坐果率测定由图2可看出,不同花龄花授粉后,同一花龄花的不同组合即丰水自花授粉、菊水自花授粉以及以丰水×菊水的异花授粉,都表现为异花授粉坐果率最高,菊水自花授粉坐果率较低,丰水自花授粉坐果率最低。如在当天授粉中,异花授粉坐果率达71.5%,菊水自花授粉坐果率为13.7%,而丰水只有6.1%。自花授粉中,开花2d后的自花授粉坐果率较开花当天略有下降,而开花4d后的自花授粉坐果率较开花2d后却显著地上升,即丰水和菊水分别由4.5%和10.3%上升到9.9%和18.9%;蕾期自花授粉坐果率提高的更显著,特别是开花4d前的蕾期授粉,丰水和菊水坐果率分别高达25.2%和30.4%,然而,开花6d前的自花授粉坐果率较开花4d前的坐果率有所下降,丰水和菊水分别由25.2%和30.4%下降到19.8%和26.6%;在异花授粉中,除从开花2d前到开花2d后(-2,0,+2)坐果率变化不明显外,开花4d后特别是开花4d前和开花6d前的异花授粉坐果率都显著地下降,分别为67.7%、53.7%和48.6%,这些结果与授粉后96h花柱基部长出花粉管占所测花柱总数的百分比一致。3不同花龄的梨发育以及不同发育的自交不亲和性有关蕾期授粉和延迟授粉对花粉萌发和生长以及坐果率的影响已有一些报道,但是结果很不一致。一般花粉和雌蕊的不亲和性表型主要决定于成熟花,因此很多研究者都试图利用蕾期授粉或延迟授粉,甚至利用贮藏后的花粉来克服自交不亲和,在这些情况下不亲和成分可能被削弱。有关蕾期授粉,在孢子体和配子体中都有成功的先例,目前,世界上广泛应用于科研的同型S合子的生产以及杂交制种。20世纪30年代和60年代就有报道将甘蓝和百合花柱进行延迟授粉并获得了一定比例的种子,但其他种属却没有成功的报道。本研究表明,无论是开花当天授粉还是蕾期授粉和延迟授粉,同一时期的自花授粉的花粉管生长和坐果情况都不如异花授粉的好,这与Hiratsuka等在梨成熟花上的研究相一致,自花授粉花粉管生长慢或弱以及坐果率低,主要是由于花柱内含有识别自花或异花花粉的特异性物质,该物质就是自交不亲和性基因(S基因)表达的具有RNase活性的特异性糖蛋白,也称为S-RNase。本试验表明在蔷薇科的梨中不仅是成熟花的花柱,在幼蕾期的花柱内也同样含有识别自花或异花花粉的特异性物质S-RNase。不同花龄的自花授粉的结果表明:不同花龄的花柱S-RNase含量不同,理论上应该为蕾期、开花后一段时间低,开花时期高。开花4d前的蕾期授粉花粉管生长和坐果又较开花4d后的延迟授粉效果好,该结论与Linsken在矮牵牛上的研究结果基本一致,矮牵牛自花授粉的最佳时间为开花后的2~4d,并且花蕾越大,抑制程度越强。Zhang等通过测定不同强度的梨自交不亲和品种的S-RNase含量已得出这样的结论,即自交不亲和性主要与S-RNase的含量呈正相关。由此推测在开花前,随着花柱发育S-RNase逐渐表达,含量不断上升,到开花时(丰水)或开花2d后(菊水),这一含量达最大值,以后S-RNase又被降解,含量开始下降。丰水和菊水自花授粉不亲和性最强时期略有差别,丰水在开花当天前后,而菊水在开花2d后,这可能与品种的特性有关,不同品种S-RNase含量变化随花蕾发育的差异有待进一步研究。自花授粉中,开花6d前的花粉管生长和坐果情况较开花4d前有所降低,这可能主要与花柱的发育及营养有关,如烟草在开花前期就没有形成花粉管生长所需的TTS蛋白。同时与早期是否形成分泌物有关,因为虽然柱头分泌物不能为花粉管生长提供营养,但可加强柱头特别是干柱头的黏着能力,因而,早期的蕾期授粉柱头上附着的花粉就比较少,以至此时的“群体效应”比较差,本试验中也表现为开花6d前的柱头上花粉附着量最少。另外,开花4d后的异花授粉坐果率有所下降,同开花6d前的坐果率不高相似,其主要原因不在S-RNase含量,也许与花柱本身的发育以及营养有关,因为此时有可能部分花柱已经衰老,花柱营养物质的导向作用的失去导致授粉受精能力下降,试验中也观察到了少量开花4d后衰老的花柱。4花龄对不同品种粉亲和性的影响不同花龄梨花授粉后荧光观察和田间坐果表明,基因型不同的品种杂交亲和,自交不亲和,并存在不同品种自交亲和性不同,丰水自交不亲和性较强,菊水自