家兔fgf5基因外显子的遗传调控研究

家兔fgf5基因外显子的遗传调控研究

对于需要毛的动物来说，它具有重要的经济价值。而动物毛被的生长是一个复杂的过程,受到一系列因素的影响,并且至今没有一个恰当的理论来解释被毛生长的调控机理。不同品种、不同个体表现出的周期性生长的差异表明,遗传因素是毛被生长调控的重要因子,而环境、营养都需要通过体内生理状况的改变而起作用,即依赖于相关基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质而进行表达,并在一定条件下对其产物进行调控。寻找影响毛质性状的候选基因一直是众多研究的目标。目前有关影响毛质性状的相关因子的研究主要集中于人和小鼠,而关于影响产毛动物(如长毛兔)毛质性状的相关因子的研究很少,大大制约了产毛动物育种的发展。成纤维细胞生长因子5(fibroblastgrowthfactor5,FGF5)属成纤维生长因子家族成员之一,是一类自旁分泌性、多功能性生物活性肽。对小鼠的研究表明,有70多种基因突变影响被毛形态,许多突变对被毛的长度无影响,有些使被毛变短,到目前为止仅发现一种突变引起被毛变长。这一突变最初被命名为go基因突变,后来的试验证明安哥拉鼠是由FGF5突变引起的,进一步的试验研究表明FGF5是影响毛囊周期性活动及被毛生长的重要生长因子。兔毛生长发育过程与毛囊/毛乳头有着密切的联系,而FGF5是唯一通过影响毛囊生长期的长短从而影响被毛长度的调控因子。国内外对与产毛性状相关基因的研究很少,家兔作为经济动物在分子遗传方面的研究更少,本研究以5个家兔群作为试验材料,对其FGF5基因外显子进行遗传变异检测,以期找到与毛质性状相关的遗传标记,为家兔毛质性状选育工作提供一定参考。1材料和方法1.1海兔、九疑山兔和毛兔来源选取5个群体共585只家兔作为试验材料。其中,60只闽西南兔来自福建省农科院,143只海狸色獭兔和101只白色獭兔来自浙江余姚兔场,72只九疑山兔来自湖南省宁远县九疑山兔原种场,209只皖江长毛兔来自江苏宜兴拉必得兔场。所有个体均为随机抽样,耳缘静脉采血5mL,并采用酚/氯仿的方法进行总DNA提取。1.2fgf5基因设计5对特异性引物,对兔FGF5基因全部CDS序列进行了扫描。FGF5-1A用于扩增家兔FGF5基因5’端及部分外显子1序列,FGF5-1B扩增余下外显子1序列,FGF5-2用于扩增整个外显子2部分序列,FGF5-3A扩增部分内含子2和外显子3序列,FGF5-3B则用于扩增外显子3剩余序列。引物由上海生工生物公司合成。引物序列如表1。1.3酶和主要试剂DNA聚合酶和dNTP均购自宝生物工程(大连)有限公司。EarⅠ和TaqⅠ酶购自宝生物工程(大连)有限公司。1.4pcr和taq酶检测PCR扩增总体积为20μL:1μLDNA模板(100ng/μL),2μL10×PCRBuffer,1.5μLdNTPs(10mmol/L),上下游引物各1μL(10pmol/μL),Taq酶0.2μL(5u/μL),ddH2O13.3μL。PCR扩增程序:95℃预变性5min;94℃变性40s,适宜温度退火40s,72℃延伸40s,35个循环,最后72℃延伸10min。1.5rflp技术引物FGF5-1A和FGF5-3B扩增产物分别用EarⅠ和TaqⅠ酶通过RFLP技术进行酶切。而FGF5-1B、FGF5-2、FGF5-3A引物的扩增产物则采用SSCP技术进行分析,由上海生物工程有限公司进行双向测序。1.6序列比对和突变位点筛查统计基因型频率、等位基因频率、多态信息含量(PIC)、期望杂合度(He),并对各群体基因型分布差异进行卡方检验,Align软件进行序列比对和突变位点的筛查。若PIC<0.25,则该群体为低度多态;若0.25≤PIC≤0.50,则该群体为中度多态;若PIC>0.50,则该群体为高度多态。若P值>0.05,则认为该群体处于Hardy-Weinberg平衡。若P值<0.05,则认为该群体不处于Hardy-Weinberg平衡。2结果与分析2.1研究发现fgf5-3b的表达用5对特异性引物扩增家兔FGF5基因,对PCR产物进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,扩增片段长度与预期大小一致,且特异性较好。其中,FGF5-1A和FGF5-3B检测到了变异位点。FGF5-1A的PCR产物经RFLP检测后发现3种基因型(A1A1、A1A2和A2A2型)(图1)。A1等位基因经酶切后得到3个片段,分别是79bp、127bp和143bp;A2等位基因经酶切后得到2个片段,分别是79bp和267bp。A2等位基因在模板序列285~287位点存在TCT缺失(geneID:100316906)(图2),从而导致所编码的多肽链68位点缺失一个丝氨酸(proteinID:XP_002717035.1)。将FGF5-3B扩增出的产物经RFLP检测后发现2种基因型(B1B1和B1B2型)(图3)。B2等位基因经酶切后得到2个片段,分别是57bp和231bp。A2等位基因在模板序列19054位点存在T→C突变(GeneID:100316906)(图4),从而导致所编码的多肽序列201位点一个Leu变为Ser(proteinID:XP_002717035.1)。2.2不同家兔群体的ssc-pcr扩增结果所检测的群体中,FGF5-1A的3种基因型只有在海狸色獭兔和白色獭兔群体中同时被发现,闽西南兔和九疑山兔群体均检测到A1A1、A1A2基因型,而皖系长毛兔群体只检测到A1A1基因型,且5个家兔群体均处于哈代-温伯格平衡(表2)。獭兔群体表现为中度多态,其中,有色獭兔的期望杂合度和多态信息含量最高,分别为0.327和0.274。肉兔群体表现为低度多态,毛兔无多态。由表3可知,皖系长毛兔基因型分布与其他4个家兔群体之间均存在极显著差异(P<0.01),九疑山兔与海狸色獭兔之间分布差异显著(P<0.05),其他群体间分布差异不显著(P>0.05)。FGF5外显子2的长度约为100bp,本研究中所进行扩增的引物涵盖了其整个外显子2序列,但是未检测到突变位点。FGF5-3A和FGF5-3B两对引物均发现了同一突变位点,即在FGF5-3B扩增产物中发现了T19054C突变(图4),Leu突变为Ser。但FGF5-3A的SSCP分析中,其构象差异不大,并未能发现其条带的差异,而FGF5-3B在胶图上只分辨出2种基因型,即有一种基因型无法区分,因此对于该区段未进行数据统计。这与李春笑等的试验结果相同,他的研究中也未能发现19054位点碱基同为CC的纯合子基因型。3家兔fgf5基因外显子的多态性分析近年来,FGF5基因对鼠被毛影响的研究较为深入。有研究证明该基因的突变对被毛的长度有显著影响,并检测到该基因在皮肤毛囊的表达,同时用体外注射蛋白产物进一步验证了FGF5的蛋白产物对不同时期毛囊生长具有一定的影响。之后,有人对不同品种的绵羊、山羊、狗和猫等动物群体进行了FGF5基因的序列分析,发现多处突变位点,并通过相关分析发现这些突变位点与毛发的长度有关。而本研究在进行序列分析后,在FGF5基因外显子1发现一处TCT(丝氨酸)插入/缺失,此处的插入/缺失可能造成氨基酸序列一个丝氨酸的缺失;在外显子3发现一处T→C突变,可能造成氨基酸序列一个亮氨酸变为一个丝氨酸,有可能改变了蛋白质或是多肽的部分功能,影响了兔毛生长周期的某个或者几个阶段,使得兔毛长得更长。本研究对家兔FGF5外显子区域进行多态性分析。经比对发现,该基因CDS序列与其他哺乳动物间的同源性较高,与猪、牛、人、小鼠间的同源性分别为88%、90%、92%和86%。在本试验所选的5个家兔群体的FGF5基因外显子1中,A1等位基因均为优势等位基因,在皖系长毛兔群体中未发现A2等位基因,可能是由于A1等位基因决定了长毛兔的长毛这种表型,也可能是在长期的选育过程中造成了A2等位基因的流失;FGF5基因外显子3中,只发现了2种基因型,