家蚕转基因显微注射蚕卵解除方法的比较

家蚕转基因显微注射蚕卵解除方法的比较

自2000年，一些国内外研究机构成功获得了从pig-gybac转变座位上获得稳定遗传的转移家蚕。这种以piggyBac为介导的外源DNA导入技术后几经改进,已成为迄今制作转基因蚕的最主要和有效方法,并在家蚕基因功能研究、遗传素材创新和生物反应器开发等领域发挥了重要作用。目前,家蚕转基因研究首选的受体材料主要为多化性家蚕品种(如Nistari和pnd-w1等)的卵。家蚕多化性品种所产蚕卵在适宜的环境条件下经10d左右即可孵化,世代周期相对较短,可全年采用桑叶或人工饲料饲育,从而极大地方便了转基因操作和后续分析。但就其实用性而言,基于多化性家蚕品种转基因的局限性也非常明显:多化性品种的经济性状差,利用其创造的转基因素材很难达到实用家蚕品种(多为二化性品种,具有滞育期)的经济性状;多化性品种不具有滞育期,利用其制作的转基因蚕必须依靠连续的饲养繁殖方能维持和继代,从而增加了生产成本和转基因系统丢失的风险。这些问题也是基于多化性家蚕品种获得的转基因家蚕只能作为基础研究和育种原始材料,而难以在生产中直接推广应用的根本原因。因此,从家蚕品种分子改良应用的实际需求出发,尽快建立实用家蚕品种有效转基因技术,尤为必要。建立实用家蚕品种转基因技术,首要技术环节是建立高效的适合于显微注射的蚕卵滞育解除的方法,研究人员为此进行了许多探索。唐顺明等采用低温催青和浸酸方法比较了二化性家蚕品种(品系)转基因用蚕卵的滞育解除效果;Inoue等采用即时浸酸方法解除二化性突变品系Nd-sD卵的滞育并注射获得了转基因家蚕。上述研究为建立实用家蚕品种转基因技术提供了有用参考。本研究以现行生产中推广应用的优良家蚕品种为材料,采用不同的蚕卵滞育解除方法,探索解决二化性家蚕品种转基因注射蚕卵不能及时和高效孵化的难题,完善实用家蚕品种的转基因技术体系,为下一阶段开展其分子改良,创造经济性状优异的新型家蚕品种提供技术支撑。1材料和方法1.1供试品种及试剂供试家蚕品种为二化性,其中7532、湘辉由广西壮族自治区蚕业技术推广总站提供,871、872、洞·庭、碧·波、秋丰由重庆市北碚蚕种场提供,对照品种P50由本研究室保存。piggyBac供体质粒pBac[3×P3DsRedaf]、pBac[3×P3EGFPafm]和辅助质粒pHA3PIG由本研究室改建或保存,注射质粒DNA采用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN公司产品)抽提。1.2蚕卵的冲洗和低温催青分别采用3种方法解除供试家蚕品种蚕卵的滞育。早期浸酸(参照文献的方法并改进):收集产下后2.5h的蚕卵,用15.16%HCl于46℃水浴处理2.5min,然后用自来水冲洗蚕卵约10min。低温催青(参照文献的方法并改进):经长期冷藏或即时浸酸处理后解除滞育的当代蚕卵于15℃低温环境中催青,孵化幼虫置于25℃、相对湿度75%的环境中饲育。复式催青按下述方法对催青温度和饲育环境进行优化:经长期冷藏或即时浸酸处理后解除滞育的当代蚕卵于15℃黑暗环境中催青,孵化幼虫在1~3龄期间置于23℃黑暗环境中饲育,随后转移至27℃光照环境中饲育,化蛹后取出蛹体置于25℃光照环境中直至化蛾。1.3质粒的制备和注射将交配后的雌蛾投放于上浆的牛皮纸上,保持其在黑暗的环境中产卵。收集产下后2h左右的蚕卵依次排列于载玻片上(约100粒/片),经35%~37%甲醛蒸气消毒2~3min后进行显微注射。按n(供体质粒)∶n(辅助质粒)=1∶1混合注射质粒,并配制为终浓度400ng/μL注射质粒液,每粒蚕卵注射10~15nL,注射后采用无毒胶水(instantstronggluemini,日本Fukui公司产品)封闭注射孔,经甲醛蒸气再次消毒2~3min后,置于25℃、相对湿度90%的条件下催青。孵化幼虫(G0代)采用桑叶或人工饲料饲育。将G0代的蚕蛾采用自交或回交制种,获得的G1代蚕卵于点青期前1d置于体视荧光显微镜(Olympus,日本)下检测,筛选在眼睛或神经组织(3×P3启动子的特性)发荧光的转基因阳性个体,以蛾圈为单位单独饲育。2结果与分析2.1不同品种蚕卵滞育解除率的比较对供试家蚕品种P50、871、872、碧·波产下卵采用早期浸酸方法处理,统计其孵化率,结果如表1所示:早期浸酸解除了4个家蚕品种产下蚕卵的滞育,但滞育解除效果均低于预期,且导致了较多的死卵;不同家蚕品种蚕卵的滞育解除率有较大差异,其中碧·波>872>871>P50;日系品种(872、碧·波)的孵化率高于中系品种(P50、871),推测这可能是因二者遗传背景不同和卵壳构造差异所致。以872和碧·波产下卵为材料,经早期浸酸处理后立即进行转基因注射,结果表明(表2):显微注射后蚕卵的孵化率均不足2.00%,远低于未经注射的蚕卵孵化率;只有从碧·波的2个批次中筛选出了阳性个体,但阳性蛾圈率较低,仅为4.35%和7.14%。这可能是因早期浸酸处理延误了最佳注射时间(蚕卵产下后2~3h注射最佳),以致外源piggyBac发生转座整合的概率大大降低甚至不发生整合。2.2中系蚕卵滞育解除率检测对供试家蚕品种的蚕卵采用15℃低温催青,以25℃常温催青作为对照,结果显示(图1):4个中系品种P50、871、秋丰和洞·庭的蚕卵经15℃低温催青后,其子代卵均可解除滞育,滞育解除率分别达到100%、100%、96.83%和91.89%,而对照组蚕卵的滞育解除率低于2.00%,说明15℃低温环境条件更容易诱发滞育性蚕卵解除滞育,使胚胎发育;日系品种与中系品种之间的滞育解除存在显著的差异,日系品种872和碧·波子代卵的滞育解除率仅为19.44%和11.11%,25℃条件下未能解除蚕卵滞育,推测可能温度以外的其它环境因子的影响对日系蚕品种蚕卵的滞育有效解除更为重要。以中系品种P50、871和秋丰的蚕卵为材料,经15℃低温催青后,正常饲养,取子代蚕卵进行转基因显微注射,结果如表3所示:显微注射后P50的孵化率有所降低,871和秋丰的孵化率则显著降低,可见显微注射操作对蚕品种蚕卵的孵化率仍有较大影响;3个家蚕品种均筛选获得了阳性个体,P50的阳性蛾圈率较高,871和秋丰因可供检测的蛾圈数很少,尚难评价其转基因效率。2.3滞育解除率及转导率为更有效地解除实用家蚕品种蚕卵的滞育,提高其转基因效率,进一步优化催青条件,对供试家蚕品种蚕卵进行复式催青,结果表明(图2):采用优化后的复式催青方法,中系品种P50、871、秋丰和洞·庭子代卵的滞育解除率达到100%;日系品种872、碧·波、湘辉和7532子代卵的滞育解除率也分别达到94.74%、80.00%、77.42%和82.16%,显著优于15℃低温和25℃常温催青方法,整体优于早期浸酸方法。以经复式催青后的碧·波、湘辉和7532的子代卵为材料进行转基因实验,结果如表4所示。尽管因显微注射等机械损伤,注射后蚕卵的孵化率(33.79%~63.78%)有所降低,但完全可以满足后续实验要求。从3个供试家蚕品种中均筛选获得了阳性个体,阳性蛾圈率达25.00%左右,与多化性蚕品系的转基因效率相当,表明基于复式催青的显微注射转基因方法是可行和有效的。3家蚕品种自身滞育特性及转化学成分的检测与分析家蚕品种是蚕业生产中最为重要的生产资料,决定着蚕丝产量、品质乃至行业整体效益。随着家蚕全基因组序列的测定和功能基因的发掘,蚕丝产业对利用转基因等技术进行实用家蚕品种分子改良,促进功能基因研究成果早日应用于生产的需求愈显迫切。基于此,本研究在前期建立了多化性蚕品系Nistari和二化性品系P50有效转基因技术基础上,从首先打破蚕卵的滞育着手,成功建立了基于复试催青解除蚕卵滞育方法的实用家蚕品种有效转基因技术体系。滞育是家蚕等生物物种积极适应不良环境和保持种族绵延的重要生物学特性。经过数千年的选择和驯化,家蚕已形成性状迥异的品种资源类群,并在茧丝产量与品质等主要经济性状表现出了明显的地域依赖性或偏好性。特别是因对自然环境条件的敏感,包括现行推广的家蚕品种在内,许多家蚕品种(品系)均表现出滞育特性,这为实用家蚕品种转基因技术及其分子改良研究带来了极大困难。一是遗传亲本来源的复杂性和地理环境的选择作用赋予了各类家蚕品种以不同的滞育特性,从而产生了胚胎发育时期上的诸多差异,针对不同的家蚕品种,往往需采用不同的条件解除其蚕卵滞育,而即便是同一家蚕品种,采用不同的条件处理,蚕卵滞育解除效率也会存在差异。二是蚕卵的滞育是以每粒卵为单位决定的,解除滞育的蚕卵胚胎发育的整齐度以及孵化率受温度、湿度、光线和空气等多个环境因素影响,从而直接影响着显微注射后的转基因效率。既要高效解除蚕卵滞育,又要使蚕卵孵化齐一,就必须综合考虑上述因素。因此,可以说几乎每个实用家蚕品种均需要采用特定的蚕卵滞育解除条件以建立有效的转基因技术。通过本研究发现,复式催青法解除蚕卵滞育的效果最佳,其次分别为15℃低温催青和早期浸酸采用早期浸酸方法,日