第七章 常用分子生物学技术的原理及应用(二)

第七章常用分子生物学技术的原理及应用（二）Thepopulartechnologyinmolecularbiology:

principleandapplicationMolecularCloningVectorsplasmidphagecDNAgenomiclibrariescDNAlibrariesDNAligationRecombinantDNAmoleculesTransformationSelectionchromosomewalkingmolecularhybridizationDNAsequencingThepolymerasechainreaction(PCR)inversePCRreversetranscriptasePCR

QuantitativePCRasymmetricPCRRNAiMultiplexPCRSouthernBlottingDNAfingerprintingWesternblottingNorthernblottingArbitraryprimerPCRfluorescenceinsituhybridization(FISH)GenechiporDNAchip上一章常用技术词汇

四核酸序列分析

Nucleicacidsequenceanalysis核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)略DNA链的末端合成终止法(Sanger法)(Sanger双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′双脱氧核苷三磷酸脱去二、DNA链末端合成终止法Sanger1958年和1980年两次获Nobel奖TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBergWalterGilbertFrederickSanger1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USAHarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom

1926-1932-1918-三、DNA自动测序用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。

ABIPRISM310型DNA测序仪主要用于DNA序列分析

(包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等PE3700型DNA测序仪DNA自动测序结果举例五、生物大分子相互作用研究技术

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10X凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果图染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图六、遗传修饰动物模型的建立及应用Theestablishmentandapplicationofheredity-modifiedanimalmodel

转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。

转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术核转移技术

即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。

二、核转移技术有目的去除动物体内某种基因的技术,称为基因剔除（geneknock-out）或基因靶向灭活(genetargeting)。三、基因剔除技术四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立动物模型①单基因决定疾病模型

基因剔除获得性突变(gain-of-functionmutation)②多基因决定疾病模型七、基因组学的建立及应用Theestablishmentandapplicationofgenome人类基因组计划基因组分类病毒基因组原核生物基因组真核生物基因组一、病毒基因组1．每种病毒有__种核酸，成分为__；2．病毒核酸大小差别很大，通常为__bp；3．除__外，所有病毒基因都是__拷贝的。4．大部份病毒核酸是由__条双链或单链分子构成，仅少数RNA病毒由__个核酸片段组成．

5．真核病毒基因__内含子，噬菌体（感染细菌的病毒）基因中__内含子．6．__(有或没有)重叠基因．1．通常由__DNA分子组成2．__子结构是原核生物基因组的结构特点之一3．基因密度__，编码区比例__；重复序列__；含有同基因；GC含量变化__。4．非编码区主要为__序列5．__(有或无)转座现象。6．__DNA具有自主复制能力二、原核生物基因组一、病毒基因组1．每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；2．病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp；3．除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。4．大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成．

5．真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子．6．有重叠基因．1．通常由环状双链DNA分子组成2．操纵子结构是原核生物基因组的结构特点之一3．基因密度高，编码区比例大；重复序列少；含有同基因；GC含量变化大4．非编码区主要为调控序列5．存在转座现象6．质粒DNA具有自主复制能力二、原核生物基因组癌症艾滋病人口增长粮食短缺环境污染生命科学人类基因组计划的缘起

人类基因组计划的缘起人类基因组计划的动议过程1984年DOE委托Alta,WhiteR.,MendelsonhmM科学家举行专业会议。1985年提出人类基因组计划的动议。1986年McKusickV将从整个基因组层次上研究遗传的科学定义为基因组学。1986年DulbeccoR在“Science”上发表文章。人类基因组计划的动议过程1987年DOE和NIH下拨研究经费。1988年成立了国家人类基因组研究中心,Watson任第一任主任。人类基因组计划的目标HGP（人类基因测序计划）其目标是通过以美国为主的全球性的国际合作，在大约15年的时间里完成人类24条染色体的基因组作图和DNA全长序列分析，进行基因的鉴定和功能分析。建立指导人类进化的“说明书”（人类遗传信息数据库）人类基因组计划的发展进程预计完成30亿对碱基的测序。美国承担了全部任务的54%，英国33%，日本7%，法国2.8%，德国2.2%。中国于1999年9月加入人类基因组计划并承担了1%

的测序任务。人类基因组计划的研究策略遗传图谱：指基因或专一的多态性DNA标记的相对位置的图谱。物理图谱：确定各测序片段连接顺序及遗传标志间物理距离的图谱。序列图谱：核酸序列图。基因图谱：基因组中占2-5%长度的全部基因按照具体位置、次序排列成的线性图。1998年1998年，生产DNA测序仪的最大厂家Perkin-Elmer(简称PE)公司与文特尔领导的基因研究所合作成立了塞莱拉（Celera）遗传信息公司，并宣布他们将利用最新技术在3年内完成人类基因组的测序工作，这使得该计划处于一种公私竞争的状态，从而加快了人类基因组的研究步伐。人类基因组计划的发展进程2000年人类基因组工作草图绘制成功人类基因组计划的发展进程2001年2月12日，美、英、日、法、德、中6国科学家指出：人类基因总数只有3~3.5万个,编码序列占2%。2001年7月10日，中国“人类基因组计划”重大项目秘书长杨焕明教授宣布：在人类基因组完成图的绘制工作中，中国已率先超额（1.13%）完成所承担的任务。中国人类基因组计划发展进程1993年，中国人类基因组计划（CHGP）启动，首先开展了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”。1997年，我国启动了“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构与功能研究”项目。并在上海和北京相继成立了国家人类基因组南、北两个中心。中国人类基因组计划研究成果1%测序任务，第三条染色体3000万bp精确度99.99%发现142个基因，其中80个为预测基因癌症基因组学另一项远征计划的提出——癌症基因组计划的动议过程

（TheCancerGenomeAtlas.TCGA）2005年，一项为期10年、耗资15亿美元的计划诞生。50种主要癌症的12500份肿瘤样品中系统地搜寻常见的基因突变。（单核苷酸变异（SNP）、小插入和小缺失（indel）、拷贝数变化染色体结构重排（CNV））等。EricLander癌症基因组计划的动议过程

（TheCancerGenomeAtlas.TCGA）2005年12月13日,美国宣布启动癌症基因组计划这项为期10年的工程将帮助癌症专家阐明驱动每种不同肿瘤癌变的特殊变异行为。2020年前找到所有导致细胞癌变的基因。埃利亚斯·泽古尼癌基因组特征认证中心中央生物样品核心资源库信息资料协调中心基因组测序中心中国癌基因组计划发展进程

吕有勇教授为CCGC秘书长。初步确定选择我国常见的高发肿瘤（食管癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、白血病等）进行基因组分析工作，首先选择胃癌进行探索。进展

卵巢癌神经胶母细胞瘤

结肠癌乳腺癌白血病

子宫癌等肺癌2.3万个变异是患病细胞所特有的，几乎所有变异是由60种左右的烟雾中的化学物质造成的。黑素瘤皮肤癌3.3万个变异是由直接暴晒阳光造成的。新生儿快速DNA诊断(3500geneticdiseases)解码儿童肿瘤(3yers,65million)基因组“巨变”诱导癌症发生七、转录组学的建立及应用Theestablishmentandapplicationoftranscriptome转录组学转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数。

转录组学实验方法基于杂交技术的芯片技术包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片基于序列分析的基因表达系列分析SAGE

（serial

analysis

of

gene

expression，SAGE）和大规模平行信号测序系统MPSS(massively

parallel

signature

sequencing,MPSS)。

我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学），涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技术生命科学正迅速地演变为一门信息科学美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划。（多部门参加）多所名校（斯坦福大学、麻省理工学院、英国剑桥大学及部分国立实验室如ArgonneOakridge也参与了该项目的研究和开发。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。而主要仍以少数几家公司为主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。国内目前主要如清华大学（程京）、中科院生命科学院、上海复旦大学、北京军事医学科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司，而且可能还有一大批公司相继成立。基因芯片是信息时代的产物横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学等现代高科技2.什么是基因芯片

生物芯片，将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分子各种生物分子存在的量的一种技术。基因芯片（genechip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交的芯片。

生物芯片的分类生物芯片的分类根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。基因芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析Measurements:images,quantitation,specifications10.基因芯片的应用基因芯片具有巨大的应用前景1.基因功能分析研究2.检测与疾病相关的基因,进而用于疾病诊断3.药物筛选,4.检测基因突变5.其他(环境化学毒物的筛选

\体质医学的研究)基因功能分析研究将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。通过相关基因进行疾病诊断目前主要涉及：癌症、血液病、心血管疾病、遗传性疾病、神经系统疾病、部分感染性疾病、毒物引起的损伤、免疫反应相关性疾病等。Golubetal,Science,286(5439):531,Oct15,1999药物筛选

在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（highthroughoutscreening），可使新药开发获得技术上的突破。帮助中医药走向世界研究天然药物对人体的作用机制筛选对人体有生物效应的单味天然药物筛选对人体有生物效应的有效成分筛选对人体有生物效应的天然药物配方中药的研究。尤其中药中众多成分中有效成分的筛选、有效药物的筛选、中药毒理学过程均被大大简化，将推动中药的迅猛发展。中药学引入基因芯片技术，将大大推动中药研究的国际化进程，为阐明中药作用机理，具有无可估量的重要意义。

蛋白质组学蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。蛋白质组学的概念及发展进展

蛋白质组（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因组表达的所有蛋白质）。1994年由Williams和Wilkins提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。蛋白质组和蛋白质组学的概念对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组：蛋白质组学(proteomics)

指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。

主要研究内容

了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；

明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；

描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。

表达蛋白组学ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics蛋白质组功能模式

Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白质组研究包括两个方面：基因组转录组蛋白组ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified功能蛋白质组学

(functionalproteomics)的提出

功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。

从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。发展进展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）

美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。

Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋