发酵工程应用实例 谷氨酸发酵

谷氨酸发酵一、谷氨酸产生菌

1.种类：谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、嗜氨小杆菌、硫殖短杆菌。我国使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌AS1.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6~13等。谷氨酸棒杆菌呈一端膨大的棒状，折断分裂形成“八”字状排列2.形态上共同特点（芽孢杆菌除外）:（1）革兰氏阳性（2）菌体为球形、短杆至棒状（3）不形成芽孢（4）没有鞭毛，不能运动（5）都是生物素缺陷型（6）都是需氧型微生物二、谷氨酸合成途径1.谷氨酸合成的方式（1）氨基转移作用

-酮戊二酸+氨基酸谷氨酸+

-酮酸（2）还原氨基化作用

-酮戊二酸+NH4++NADPH2谷氨酸+NADPH+H2O2、谷氨酸合成途径

谷氨酸的生物合成过程中的几个途径

主要有：（1）糖酵解途径（EMP途径）（2）磷酸己糖途径（HMP途径）（3）三羧酸循环途径（TCA循环）（4）乙醛酸循环途径（DCA循环）（5）伍德-沃克反应（CO2固定反应）（6）α-酮戊二酸的还原氨基化反应这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：葡萄糖

②HMP3-磷酸甘油醛丙酮酸乙酰辅酶ACO2草酰乙酸柠檬酸苹果酸异柠檬酸延胡索酸琥珀酸NADPHα-酮戊二酸NADPHNH4+谷氨酸乳酸乙酰辅酶A④乙醛酸循环乙醛酸①EMP③TCA谷氨酸⑤CO2固定透过细胞膜⑥α-酮戊二酸的还原氨基化的几个途径谷氨酸的生物合成过程中三羧酸循环（TCA）4.谷氨酸产生菌的生化特征（1）CO2固定能力强。（2）

-酮戊二酸氧化能力微弱:

-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低。（3）异柠檬酸裂解酶活力微弱。（4）谷氨酸脱氢酶活性强。（5）还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱。（6）不利用谷氨酸。（7）耐高糖耐高谷氨酸。（8）解除谷氨酸反馈抑制。（9）具有向胞外分泌谷氨酸的能力。

谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是：（一）菌体代谢调节控制（二）细胞膜通透性的特异调节（三）发酵条件的适合三、谷氨酸代谢的调控（一）菌体代谢调节控制

1.谷氨酸生物合成的调节机制琥珀酸

-酮戊二酸脱氢酶（弱）

-酮戊二酸

谷氨酸脱氢酶（强）谷氨酸透过细胞膜谷氨酸（二）细胞膜通透性的特异调节用能积累谷氨酸菌株做如下实验:生物素充足时,细胞内含大量谷氨酸,但培养液里几乎不含谷氨酸用溶菌酶消化细胞壁得到的原生质体仍不分泌谷氨酸当把原生质体放入低渗溶液里,将其涨破,谷氨酸才排出生物素亚适量时,培养液里含大量谷氨酸,细胞里含量少结论:谷氨酸的分泌是由细胞膜控制控制细胞膜通透性的方法：控制磷脂的合成；控制细胞壁的合成：选育温敏突变株

1.控制磷脂的合成

①生物素营养缺陷型作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成。当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外漏出，积累于发酵液中。控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10

g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.突变株

②油酸营养缺陷型作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.突变株③甘油缺陷型作用机理：丧失L-甘油-3-磷酸(NADP氧化还原酶)，不能合成a-磷酸甘油和磷脂，只有添加甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂的含量，使谷氨酸得以积累。控制的关键：添加亚适量的甘油或甘油衍生物。甘油过少，菌株生长不够好;甘油过量，磷脂合成正常，产谷氨酸低。突变株添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸。机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜。关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞。其他④添加表面活性剂⑤添加青霉素机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.

其他（三）发酵条件的控制（1）发酵温度谷氨酸发酵前期(0~12h):30-32℃。对数生长期:菌体浓度迅速增大（12h），糖耗快，维持温度30-32℃在发酵中、后期:是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在32-36℃。

（2）

pH值1）pH值对谷氨酸产生菌生长的影响2）pH值对谷氨酸积累的影响发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.5~8.0左右较为合适。而在发酵中、后期将pH值控制在7.0~7.6左右对提高谷氨酸产量有利。（3）通风在谷氨酸发酵过程中，发酵前期以低通风量为宜；发酵中、后期以高通风量为宜。实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。

（4）

泡沫的控制在发酵过程中由于强烈的通风和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生大量的泡沫，不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸和代谢。给发酵带来危害，必须加以消泡。消泡方法：机械消泡(耙式、离心式、刮板式、蝶式消泡器)化学消泡(天然油脂、聚酯类、醇类、硅酮等)（5）

发酵时间不同的谷氨酸产生菌对糖的浓度要求也不一样，其发酵时间也有所差异。低糖(10%~12%)发酵，其发酵时间为36~38h，中糖(14%)发酵，其发酵时间为45h。五、谷氨酸发酵工艺整个过程可简单的分为2个阶段:1.菌体生长阶段;2.产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。发酵过程参数测定还原糖的测定谷氨酸的测定菌体形态观察菌体浓度测定发酵过程参数的控制OD值pH温度搅拌速度发酵发酵液冷却接种三角瓶培养固体斜面培养上罐实消培养基的配制谷氨酸发酵的工艺流程简图1.菌种扩大培养斜面培养→一级种子培养→二级种子培养→发酵（1）斜面培养菌种都是需氧微生物，都需要以生物素为生长因子。斜面培养基蛋白胨牛肉膏氯化钠pH7.0~7.2琼脂在32℃培养18～24h经质量检查合格，即可放冰箱保存备用。（2）一级种子培养培养基葡萄糖玉米浆尿素磷酸氢二钾硫酸镁硫酸铁硫酸锰pH6.5～6.8在32℃培养12h，如无杂菌与噬菌体感染，质量达到要求，即可贮于4℃冰箱备用。以1000mL三角瓶装液体培养基200～250mL进行振荡培养。（3）二级种子培养二级种子用种子罐培养，料液量为发酵液投料体积的1％，培养基组成和一级种子相仿，主要区别是用水解糖代替葡萄糖，一般于32℃下进行通气培养7～10h经质量检查合格即可移种（或冷却至10℃备用）。种子质量要求，首先是无杂菌及噬菌体感染，在这个基础上进一步要求菌体大小均匀，呈单个或八字形排列。二级种子培养结束时还要求活菌数为108～109个细胞/mL。3.谷氨酸发酵发酵初期，即菌体生长的迟滞期，糖基本没有利用，尿素分解放出氨使pH值略有上升。一般为2～4h。接着进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升，但随着氨被利用pH值又下降；溶氧浓度急剧下降，然后又维持在一定水平上；菌体浓度（OD值）迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。这个时期，为了及时供给菌体生长必需的氮源及调节培养液的pH值至7.5～8.0，必须流加尿素；又由于代谢旺盛，泡沫增加并放出大量发酵热，故必须进行冷却，使温度维持30～32℃。菌体繁殖的结果，菌体内的生物素含量由丰富转为贫乏。这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。3.谷氨酸发酵当菌体生长基本停滞就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α－酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所必需的氨及维持谷氨酸合成最适的pH7.2～7.4，必须及时流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成最适的温度34～37℃。发酵后期，菌体衰老、糖耗缓慢、残糖低，此时流加尿素必须相应减少。当营养物质耗尽酸浓度不再增加时，需及时放罐，发酵周期一般为30多小时。4.谷氨酸提取从谷氨酸发酵液中提取谷氨酸的方法，一般有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法，以及将上述某些方法结合使用的方法。发酵液↓起晶中和点pH4～4.5↓育晶2h↓等电搅拌pH3～3.22↓静置沉淀4～6h↓离心分离↓谷氨酸200波美盐酸母液菌体及细小的谷氨酸（1）等电点法操作方便，设备简单，一次收率达