微卫星dna分子标记的研究进展

微卫星dna分子标记的研究进展

分子标记是近20年来建立的一种新的遗传标记技术，经过标记、生化免疫标记和细胞遗传标记。它在ct上显示了遗传物质的遗传变化，是动物遗传育种领域的一项新兴技术。目前常用的分子标记主要有:限制性核酸内切酶酶切片段长度多态标记(RFLP),随机引物扩增多态(RAPD)标记,扩增片段长度多态(AFLP)标记,小卫星DNA标记,微卫星(SSR)标记及单核苷酸多态性(SNPs)等。1普lymorphismssp微卫星(Microsatellite)DNA也称为简单序列重复(simplesequencerepeat,SSR)、简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymorphism,SSLP)。微卫星序列的重复单位小,是由2～6bp的短核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列,它广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上,大约每隔5～50kb就存在一个微卫星,由于微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大而形成多态性,一般来说,微卫星DNA的重复序列两侧都有特异性的保守序列,所以,通过设计引物对基因组DNA进行PCR扩增,电泳和反射自显影,即可检测到多态性,这就是微卫星DNA分子标记,目前已成为取代RFLP的第二代分子标记。2伟兴dna多态性检测原理和方法微卫星分子标记的原理:获得微卫星序列—设计引物—PCR扩增—对扩增产物进行分析。2.1数据库的建立为了从微卫星DNA中获得有效的生物学信息,微卫星位点的获得是微卫星分析的关键(张于光等,2001)。微卫星位点获得的途径主要有两种:一种是构建基因组文库法。这种方法包括DNA文库的构建、筛选克隆片段、测序和根据序列设计PCR引物以进行微卫星位点的扩增(张于光等,2001)。二是通过计算机检索法。检索Genbank(美国基因、蛋白数据库)、EMBL(欧洲分子生物学实验室数据库)和DDBJ(日本国家遗传研究所基因数据库)等DNA序列数据库,从互联网上获得含有微卫星的序列(徐莉等,2002)。这种方法简单、易行,省去了构建基因文库、杂交、测序等繁杂的工作。2.2同一物种或其它基因型的微卫星断层微卫星两侧的序列在同一物种是高度保守的,所以可以根据其保守序列设计引物,用以扩增同一物种甚至其它物种其他基因型的微卫星片断。引物设计的原则同一般PCR扩增引物的设计。2.3dntp用量的影响引物设计好以后,就可以进行PCR扩增,扩增时要选择合适的条件,一般可通过改变dNTP,Mg2+,Taq酶的浓度,退火温度和时间获得特异性扩增产物,然后对结果进行比较,选出有区别性的引物。3微卫星的遗传ropd微卫星分子标记是目前发展最快的分子标记之一,与其他的分子标记RFLP、AFLP、RAPD相比,微卫星标记的优点主要表现在:①具有丰富的多态性。微卫星DNA本身重复单位数的变异是形成微卫星位点多态性的基础,多态性常表现为复等位性(Littetal,1989)。它与蛋白质标记相比,微卫星多态性变异程度为80%,蛋白质多态性为28%;微卫星平均等位基因数为5.2,蛋白质多态性为3.0;微卫星平均群体杂合度为47%;蛋白质多态性为26%(王栋等,2000)。这一特点也是RFLP和RAPD不能相比的。对于RFLP来说,它主要是由于碱基突变导致限制性酶切位点的丢失或获得,所以大多数RFLP表现为二态性,杂合率低于50%,所提供的信息含量低,多态信息含量仅为0.2左右。而RAPD仅表现出显性遗传,不能区分杂合子和纯合子(刘榜等,1997)。②数量多且分布均匀。③保守性。大多数微卫星所在区域在生物的基因组中是比较保守的。从牛基因组中筛选出的用于扩增微卫星的PCR引物有56%可用于羊,3%可用于马(Mooreetal,1991)。Dietz等(1993)直接从羊基因组中分离得到的7个微卫星座位中的5个定位到牛的相应同线组中。M.j.deGortari等(1997)利用1036个牛的微卫星引物检测其在绵羊基因组中的扩增情况,表明大约有58%(605/1036)的引物可以在绵羊的一个位点中得到扩增,大约有69%(409/605)各扩增位点呈现多态性。④共显性遗传。微卫星DNA呈孟德尔共显性遗传模式,可以区别纯合显性个体和杂和显性个体,这为遗传研究提供了更多的可供分析的信息。储明星(2002)对小尾寒羊、多塞特羊、多塞特公羊×小尾寒羊母羊3个绵羊群体159只绵羊进行了遗传检测,证实了微卫星DNA的共显性遗传特性。⑤适合于进行高度自动化分析。微卫星区域通常长度为100～300bp,这就很容易进行PCR扩增,PCR的高度灵敏性、高度特异性及操作简便、省时使微卫星标记的检测十分方便而且可靠(张吉清等,2001)。4共显性标记的应用微卫星随机分布于整个绵羊基因组中,且是一种共显性标记,已应用于绵羊遗传图谱构建、种质鉴定、遗传多样性分析、种质资源保存和利用,基因标定和标记辅助选择育种以及杂种优势利用等分析。4.1微卫星标记在养羊业上的应用据估计,哺乳动物基因组中微卫星的平均拷贝数约为5万～10万个,Crawford(1996)报道,在绵羊每个配子上微卫星位点的自发突变率为(1.1±0.5)×10-4。所以经过不断的突变,不同品种在漫长的进化过程和人为选择下,其微卫星核心序列重复数发生不同方向、不同程度的变异,从而形成本身特有的DNA指纹图。BuchananF.C.等(1994)利用微卫星标记研究了罗姆尼羊、边区莱斯特羊、萨福克羊、澳大利亚和新西兰美利奴羊品种的遗传关系,推断出了这些品种的分化时间。Forbe等(1995)研究了8个不同微卫星标记在家绵羊和一种野绵羊群体间的变异,得出家绵羊比野绵羊具有更大的遗传变异性。储明星利用与Booroola羊高繁殖力主效基因FecB紧密相连的两个微卫星标记OarAE101和BM1329分析了小尾寒羊等5个绵羊品种的多态分布情况。用微卫星DNA进行个体识别和分子鉴定是一项新兴的生物技术,在家畜上应用的报道不少。目前国内有人应用微卫星标记对克隆动物进行验证,陈苏民、陈南春(2000)对克隆山羊的体细胞供体、受体、济宁青山羊母羊、公羊和羔羊进行了微卫星DNA分析证明克隆山羊与体细胞供体山羊的微卫星DNA的PCR扩增电泳结构完全一致,与受体母羊和另外3只青山羊没有直接的血缘关系。应用微卫星对家畜进行系谱确证是非常适合的,比如在家畜育种中必须搞清楚畜群的亲子关系,这样才能利于根据亲属信息准确选留个体并能防止群体近交的发生。然而在某些情况下(如寄养、母畜返情重配等),却不能准确判断某一个体的亲代。如今借助多个微卫星标记位点在群体中的等位基因频率,通过计算排除率(Exclusionprobability)便可进行亲子鉴定和血缘控制。Ellegren等研究表明,组合使用5个微卫星位点(每个位点有6个以上的等位基因)时排除率为98%,而使用10个这样的微卫星时排除率可高达99.99%。Luikart等(1999)用22个微卫星标记对可什米尔羊、蒙古羊、安哥拉羊群进行了亲子鉴定,试验准确率都高于0.9999。4.2阿斯塔纳的afec基因和羊毛纤维直径基因的扩增和形成分子遗传标记和QTL间的连锁分析为检测QTL提供了新的手段。目前,绵羊中已经有少数主效基因被检测出来和大致定位。绵羊Booroola基因是高产仔数主效基因,采用2代全同胞作参考群体进行的连锁分析表明该基因与OarAE101DNA标记连锁,两座位间相距13cM,位于第6号染色体上。Gootwine等(1998)证明微卫星标记BM1329的A等位基因(而不是B或C等位基因)与FecB位点的B等位基因连锁。与绵羊繁殖力和存活力有关的Inverdale基因定位于绵羊X染色体上。该基因在杂合状态时可提高排卵率且产仔数增加0.6个,而在纯合状态时母羊是不发情的或出现斑痕卵巢并且母羊是不育的。Gootwine等(1998)通过回交三代群体内的杂合体互交,已鉴别出OarAE101和BM1329两个标记纯合进而FecB等位基因纯合的公羊和母羊,这些公母羊在一个名为“Afec”的高繁殖力阿华西绵羊育种核心群内。绵羊Callipyge基因是引起绵羊肌肉增大,增加羊瘦肉率和提高饲料报酬利用率的主效基因,目前也正在被作为一种模式进行研究和利用。与羊毛纤维直径有关的Drysdale基因目前还没有定位到染色体上。AllainDetal(1996)在INRA401绵羊品系中对毛性状和其他性状进行QTL检测,用7个微卫星标记(分别定位在绵羊2、3、4、5、12和13号染色体上)对1200只羔羊及其它们的亲本对羊毛性状的QTL进行检测,结果发现定位在第3号染色体上的一个标记在3个家系中对毛纤维直径的变异系数、毛长和纤维色素沉着有显著效应,另有定位于第4号染色体上的一个标记在2个家系中对毛纤维直径有显著效应,表明这两个标记与QTL可能连锁。HenryH.M.等(1995)利用特细的美利奴(羊毛纤维直径为16μm)与羊毛纤维粗的鲁姆尼羊(羊毛纤维直径为40μm)的回交群体组成4个家系的参考群体,用222个微卫星标记每隔20～30cM对毛性状进行全基因扫描,采用单一标记最小二乘法进行分析,结果表明只有一个位点与羊毛直径的QTL存在显著相关。储明星等(2001)研究了两个微卫星座位,找到了与小尾寒羊产羔数有显著正相关的一个OarAE101基因座的等位基因(107bp)及基因型(107bp/111bp)和两个与产羔数有显著负相关的等位基因(109bp和111bp)。杜立新(2001)找到了与产羔数显著正相关的等位基因OarHH55-11和BM143-12各一个标记。Lord等(1998)通过在EGF和微卫星标记OarAE101之间加入两个微卫星位点MCM53和OarJL1A以及一个基因位点着丝粒自身抗原E(CENPE),进一步将FecB精确定位在绵羊6号染色体着丝粒区的微卫星标记OarAE101和BM1329之间一个10cM区间内。Mulsant等(1998)对绵羊6号染色体FecB(Booroola)区域进行了区间定位,报道7个额外的标记被定位在FecB基因附近18cM的区间内,与FecB最靠近的侧翼标记是牛的微卫星BMS2508和山羊的微卫星LSCV043,它们位于FecB基因一侧约2cM处。4.3微卫星标记的多态性构建基因图谱是为了了解基因组的结构,是性状控制的基础和最基本的方法。在进行基因组图谱建立过程中,标记的基因位点一般有两类:一类主要由编码基因和结构基因位点构成,位点变异小;另一类为具有高度变异的重复序列来标记DNA上的基因(结构基因)位置(相对关系)。微卫星标记是微卫星中用于作图的最常用的分子标记,用于构建遗传图谱也是微卫星标记的一个主要用途。由于是一种共显性标记,不但简化了遗传分析过程,且利于不同群体间的标记转换。目前使用微卫星进行畜禽基因图谱的构建主要侧重两个方面,物理图谱的构建和标记连锁图谱的构建。基本思路是:以微卫星为基础在基因组中每隔一定距离找一个多态的微卫星标记,当建立起达到一定的饱和度(约每隔10～20cM一个,并覆盖90%的基因组)要求的基因图谱之后,可以通过连锁分析,来进行QTL定位,以确定QTL在图谱上的位置、QTL与标记之间的距离和QTL的表型效应等。1992年Crawford等发表了第一张用微卫星标记构建的绵羊遗传连锁图谱,当时所使用的微卫星标记很少,其连锁群只有6个,包括14个标记。Montgomery等(1993)建立了一个来自12只booroola基因杂和体公羊的2个世代的半同胞家系,以寻找与booroola基因连锁的遗传标记,共确定了19个连锁群,包括52个标记,其中13个连锁群定位在绵羊染色体上。Crawford等(1995)报道了现在被认为是低分辨密度的第一个包括整个绵羊核基因组2070cM的遗传连锁图。图中246个多态标记有213个是微卫星标记,有87个微卫星标记直接来自于绵羊。1998年Gortari等发表了绵羊的第二代遗传连锁图谱,其上共有标记519个,其中504个为微卫星,常染色体图谱总长度为3063cM,标记间距为6.4cM。这种高密度遗传连锁图谱的建成为基因定位、物理图谱的构建及基因的位置克隆(Positionalcloning)奠定了基础。4.4各施主效应的估计微卫星DNA标记是家畜早期选择和标记辅助选择中重要的分子标记,微卫星标记辅助选择将会改变目前群体水平上从表型值推出基因型值的选择过程。先用分子生物学技术测定个体的基因型,在估计个体的表型和育种值,原理是利用已经建立起来的基因图谱,根据微卫星与某些重要经济性状座位的连锁不平衡,采用适当的数学统计、定位方法估计两者的紧密程度,定位QTL与基因组中某一位置,并得出单个QTL产生的效应值。计算机模拟表明,微卫星标记辅助选择相对于传统的表型选择来说,可以获得更大的遗传进展,尤其对于低遗传力性状、限性性状和后期表达的性状,能增大选择强度,缩短世代间隔,提高选择的准确性。同时有目的地导入有益基因,剔除不利基因,以此提高群体的生产性能或生活力,缩短育种年限(张吉清等,2001)。Gootwine等(1998)已利用微卫星标记OarAE101和BM1329对FecB携带者(布鲁拉阿华西杂种羊)进行了标记辅助选择。在纯种阿华西羊群体中鉴别出BM1329位点有3个等位基因A、B、C,其等位基因频率分别为0.04、0.38、0.58。Booroola×Awassi回交二代和回交三代杂种母羊中,BM1329标记为A等位基因的母羊平均产羔数比BM1329标记为B或C等位基因的母羊要多0.6(P<0.05)。当然,标记辅助选择并不能代替传统的选择方法,只有两者结合起来,才能获得更大的进展。4.5应用微卫星标记进行杂交组合的研究微卫星标记属于共显性标记,利用这种标记,从潜在种质资源中系统鉴别出现有杂交组合的两个亲本表现杂合互补的染色体区域,借助计算机分析杂种优势组合与微卫星位点杂合性之间的相关性,则有可能检测出产生杂种优势所必需的杂合性染