质谱分析在蛋白质组学中的应用

质谱分析在蛋白质组学中的应用TOC\o"1-5"\h\z（摘要 2\o"CurrentDocument"1、 质谱 2\o"CurrentDocument"2、 蛋白质组学 2\o"CurrentDocument"3、 质谱分析在蛋白质组学中的应用 4\o"CurrentDocument"参考文献 6\o"CurrentDocument"附录1 8）16120901（生技）20092348王德美摘要：蛋白质组是基因组研究的继续，以基质辅助激光解吸附飞行时间质谱和电喷雾质谱为代表的现代生物质谱技术，为蛋白质组的研究提供了必要的技术手段。主要通过获取蛋白质、多肽的分子量以及修饰片段的信息，研究蛋白一蛋白间相互作用、翻译后修饰乃至基因表达水平的变化等方面的情况，从而扩充和完善蛋白质组学的研究【1】。本文旨在收集整理相关信息，反映质谱技术在蛋白质组学中应用的发展现状，为相关人员提供初级资料。1、 质谱质谱(MassSPectrometry)是带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。质谱仪【2】是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。1.1原理质谱分析原理是通过进样使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散一一离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。1.2生物质谱仪器长期以来，由于生物样品的非挥发性、热不稳定性以及分子量大等特征，质谱的应用仅局限于对小分子的分析。从上世纪八十年代起这一情况发生了戏剧性变化，基质辅助激光解吸附(MALDI)和电喷雾(ESI)技术【1】的发展促进了质谱仪器的巨大发展，新的质量分析器的研发和各种多级的复杂的仪器的设计和组合层出不穷。1.2.1生物质谱仪器的组成与分类用于生物领域的质谱仪通常包括三个部分【3】：离子源、质量分析器和检测器。质量分析器是质谱的核心元件，决定着生物质谱的灵敏度、分辨率、质量准确度和生成大量信息的碎片离子谱图的能力。目前在生物质谱领域有四种基本的质量分析器：飞行时间、四极杆、离子阱和傅利叶变换离子回旋共振、Orbitrap【4】，它们的设计和性能不尽相同，各有其优点和劣势。这些分析器可以独立使用，也可以串联使用以发挥各自的优点。2、 蛋白质组学2.1背景基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就【5】，大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此，在细胞合成蛋白质之后，这些蛋白质往往还要经历翻译后复杂的加工修饰，基因组学远远无法解决这些问题，因此蛋白质组学(proteomics)应运而生【6】。蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(MarcWilkins)最先提出来的【7】，最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上【8】，它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。与基因组学相比，蛋白质组学更接近生命现象的本质，在药靶研究中具有潜在价值，可通过对蛋白质性质、丰度的考察来揭示它的功能，进而找到与人类重大疾病相关的差异蛋白，使之成为诊断、治疗及药物筛选的靶分子。目前蛋白质组已被广泛用于研究各种疾病的发生、发展规律，并取得了很多重大的成就。2.2研究策略和范围蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略【9】。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式(Expressionprofile),随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴，其主要研究手段是Fields等人建立的双杂交系统【10】【11】和Vidal等人发明的逆双杂交系统【12】【13】。2.3研究方向当前蛋白质组学是在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时，进行蛋白质组分析。上述两种研究策略大体制定后制定，对蛋白质组的分析工作的两个主要方面方面也随之产生。一方面，通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱，相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面，是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化，翻译后修饰的变化，或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等【14】。2.3具体内容蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段，其内容包括：蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解°Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。3、质谱分析在蛋白质组学中的应用【15】(附录1：用质谱表征蛋白质的示意流程图)蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的发展，主要依赖于生物质谱技术的飞速发展以及高通量分离和分析技术的突破性进步。一些新的构造的具有高潜能的质谱仪被引入到蛋白质组学研究中并产生深刻影响。首先是质谱技术尤其是“软电离源”技术一一电喷雾和基质辅助激光解析离子源的发展，使之成为检测微量甚至是痕量蛋白质分子的重要手段。高通量、高效的分离技术和大规模、高效率、高准确性地鉴定一个组织或细胞乃至亚细胞中的全部蛋白质以及利用稳定同位素标记方式与多维分离-串级质谱实现大规模的蛋白质定量分析也已经使得生物质谱成为实现这一目标的核心分析技术。生物信息学的建立形成了国际性的科学大协作。目前，世界各主要国家都不惜巨资进行蛋白质组的研究。蛋白质组学研究的进一步深入，将对了解疾病的发生和药物的筛选起到决定性的作用。3.1蛋白质的分析鉴定3.1.1蛋白质分子量测定随着质谱技术的发展，分子量的测定已从传统的有机小分子扩展到了生物大分子。MALDI-MS【16】技术以其极高的灵敏度、精确度在蛋白质分析中得到了广泛的应用。该技术不仅可测定各种疏水性、亲水性和糖蛋白的分子量，还可直接测定蛋白质混合物的分子量。这可认为是蛋白质分析领域的一项重大突破。3.1.2肽指纹图谱(PeptideMassFingerprintingPMF)质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一，除了用于多肽，蛋白质的分子量测定外，还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。肽指纹图谱(PeptideMassFingerprintingPMF)测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法。质谱分析所得肽断与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较，判断出所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，不同蛋白质所得肽断具有指纹特征。采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。对肽序列的测定往往要应用串连质谱技术，采用不同的技术选择特定质核比的离子，并对其进行碰撞诱导解离，通过分析肽段的断裂情况推导出肽序列。3.1.3快原子轰击质谱技术(FABMS)【17】【18】快原子轰击质谱技术(FastAtomBomebardmentMassSpectrometry,FABMS)是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS-MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。3.2后转录修饰的蛋白质的检测和识别3.2.1蛋白质的糖修饰检测和识别通过对糖蛋白的检测和分析发现，糖蛋白中糖组分的结构和功能具有多样性。糖蛋白中的糖通常是不同种类的，而且是由一些可控数量的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期，细胞分化和发展的状态有关【19】。在蛋白组时代中，蛋白质的修饰会引起其理化性质的改变，因此是不容忽视的。从1D或2D凝胶得到的糖基化蛋白的识别，一般是进行MALDI-MS指纹分析，或是对MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片谱进行分析【20】。对完整的糖蛋白的研究是非常困难的，所有已知的离子化技术都有其局限性。目前，人们主要研究糖肽，其好处之一就是质量减小了，这就会得到更好的分辨率，而且糖肽仍保留了糖基化位点。将分离的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可进行糖肽的研究。一旦糖肽被识别出，就可以用串连质谱(ESI-MS/MS)来阐明肽序列。当蛋白的序列已知时，计算质量差就可推出其上附着的寡糖的质量【21】。要将糖部分从糖蛋白中释放出来，可用化学切割或酶切割。目前，连有结构专一性糖苷酶的质谱在提供序列、分支和链接数据方面是最有力的技术。首先用化学方法切掉修饰的糖类，将之与其他一些化合物混合，然后用MALDI-MS分析糖类，可以进一步提高灵敏度和分辨率【22】。不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂搬PSD)和碰撞诱导解离(CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息。3.2.2蛋白质的磷酸化蛋白质中氨基酸的磷酸化在生命系统中起重要的作用。磷酸化经常作为分子开关控制不同过程蛋白质的活性，如新陈代谢，信号传导，细胞分裂等过程。因此，蛋白质中磷酰氨基酸的识别在蛋白质分析中是一项重要的工作。已知的磷酰氨基酸的类型有O-磷酸盐、N-磷酸盐、乙酰磷酸盐、S-磷酸酯四种。用质谱分析磷酸化时主要存在的问题是，混合物中磷酸化肽的信号被抑制【23】。因此只有当一些非磷酸化肽的含量降低(或磷酸化的肽被富集)后，分析磷酸化的肽才会变得容易些。一些相应的用于质谱分析的前磷酸化肽或磷酸化蛋白质的分离和富集方法和技术已有所发展，现已建立的分离技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)，高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)【24】。对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测，提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析；如果32P标记不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC与质谱联用。常用的富集方法有：固定金属亲和色谱法(IMAC)IMAC是选择性分离和富集磷酸化肽最广泛的方法。此方法中，键合在螯合底物上的金属离子(通常是Fe3+或Ga3+)选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合，并且在高pH或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来。抗体免疫沉淀法高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白。目前利用抗体富集蛋白/肽仅局限于分析磷酸化酪氨酸，然后用MALDI-TOFMS分析与抗体相联接的磷酸化肽【25】【26】。尽管用于免疫沉淀的抗体对其底物必须有相对高的亲和力，但低亲和力抗体仍然可以有效地用于免疫印迹Western-blotting分析。磷酸化肽的检测和磷酸化位点的确定主要有以下MS技术：a.MALDI-TOF有两个研究组，将一个MALDI离子源和一个混合Q-TOF耦联了起来【27】。Q-TOF提供的质量准确性和敏感性提升了数据库搜寻结果并同时使它成为MS/MS从头测序的当然仪器选择。MALDIQ-TOF构造提供了激动人心的机会进行自动化和高通量应用以及在一个样品盘上存档样品进行日后研究的可能。Medzihradszky等描述了一个不同的混合仪器称之为MALDITOFTOF【28】。此设备享有许多MALDIQ-TOF的优点，另外能够进行高能量CID和非常快速的扫描速率。MALDI-TOF可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点。其原理是磷酸酯酶【29】处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOFMS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。串联质谱(MS/MS、LC-MS/MS)【30】Sequest使用CID谱设置了蛋白质识别的实验室标准(benchmark)，因为它与边界MS/MS数据工作得最好，并高度可信，可以从整个LC-MS/MS实验中自动分析数据，并不需要任何使用者的破译工作。在所提的程序中，然而，只有Sequest不能在网络上搜索。MASCOT是一个新的、快速、网络可进入和多功能的程序，具有进行肽指纹分析、用部分破译或未破译的CID谱进行数据库搜索的功能。串联质谱(MS/MS)可进行前体离子扫描，这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4(98u)的肽段。另外，由于液相色谱分离肽降低了离子抑制效应，也有人用LC-MS/MS分析磷酸化位点。傅立叶变换质谱进行电子捕获解离傅里叶-变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)质谱对于蛋白质组学来说相对陌生。这些设备具有非常高的敏感性和分辨率，质量精确性可以达到1ppm。这些特征被用来在一次分析中测量和定量几百种蛋白质的完整的分子质量【31】。测量的一个肽的准确质量以及可以容易获得的限制因素能够通过序列数据库搜索被用来识别蛋白质，蛋白质组学如果没有软件工具来进行质谱数据和序列数据库的关联将变得几无可能。现存的数据库搜索程序已经变得越来越成熟和可以(从网络)可获得。另外新的算法已被引入，主要相关程序是 Sequest，MASCOT，PeptedeSearch，PROWL和ProteinProspector[32]O将电子捕获解离(ECD)与傅立叶变换离子回旋加速共振(FTICR)【33】质谱相连是蛋白质、肽测序和研究蛋白质翻译后修饰的一个有力方法。近来，它已被成功地用于鉴定肽片段上发生磷酸化的残基。4、总结目前生物质谱被认为是大规模、高通量进行蛋白结构鉴定的首选工具，但与之结合的2-D电泳仍有缺点，如工作量大、重现性差。因此，将对其进行改进，如分子扫描技术等。由于通过LC-MS/MS可直接鉴定蛋白混合物，因此将来有望不通过2-D就能研究蛋白质组。[34]生物质谱的优势在于它能帮助我们研究蛋白一蛋白间相互作用、翻译后修饰乃至基因表达水平的变化等，但是它还需要解决一些技术问题，其中最根本的是质谱的定量问题。参考文献：[1]周毅峰，吴永尧，唐巧玉，周大寨，生物质谱在生命科学中的应用J],湖北民族学院学报(自然科学版2004年02期⑵曾嵘，夏其昌，蛋白质组，现代科学仪器2000，5：5-9PennisiE.Laboratoryworkhorsedecoded.Science,1997,277： 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