基于液相色谱-质谱联用的代谢组学技术瓶颈

基于液相色谱-质谱联用的代谢组学技术瓶颈

代谢组学是经过基因组学、转换组学和蛋白质组学之后发展起来的系统生物学的一个新分支。它是通过研究水体的外部刺激、病理生理变化以及自身突变引起的体内新陈代谢水平的动态反应来研究水体的科学。近年来,代谢组学已经广泛深入到生命科学的各个领域,并日益引起重视。代谢组学的主要分析手段有色谱-质谱联用技术(包括GC-MS、LC-MS以及CE-MS)以及核磁共振(NMR)等。HPLC(尤其是超高效液相色谱(UPLC))与大气压电离质谱(API-MS)相结合,具有良好的灵敏度、高动态范围和通用性,已成为代谢组学研究中的主流分析手段。再结合多元统计分析可较容易地实现潜在生物标志物的发现。API-MS的重现性较差,不同类型仪器间的多级质谱图变异较大,无法像GC-MS以及NMR那样在通用的数据库里进行谱图检索定性,因此在单独使用API-MS时难以确定代谢物的结构。而在代谢指纹中大部分MS信号对应的代谢物仍然不明确,结构鉴定成为基于液相色谱-质谱的代谢组学研究的主要瓶颈之一,也是研究的热点。MSI(MetabolomicsStandardsInitiative)发布了一系列关于代谢组学研究报告的规范,在文献中规定了代谢组学研究中代谢物定性的4个层次(见表1)。生物体内代谢物的数量尚无定论,数据从1000到200000不等。之所以有如此大的差异,一方面是物种差异;另一方面,是否包括脂质、理论代谢物以及外源性代谢物是差异的主要来源。目前可购买到的标准物质仅有5000种左右,包括1100种内源性的核心代谢物、1200种美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准的药物、1300种美国FDA批准的食品添加剂、1500种植物化学物质或植物次生代谢产物,代谢组学研究能真正准确定性的化合物也局限于此。因此未知物结构鉴定仍是制约代谢组学技术发展的瓶颈,我们在长期工作的基础上,针对样本中难以区分的同分异构体标志物的鉴定和识别,构建了基于微型制备、保留指数、质谱、核磁共振等的集成技术流程。而常规代谢组学研究的代谢物鉴定中,一般直接利用获取的质谱信息鉴定化合物,常见的获取候选分子结构的方式有两种:一种是直接采用获得的分子离子峰和二级质谱信息进行谱图库检索;另一种是首先进行化合物元素组成判定,再基于获取的元素组成进行数据库检索。然后通过标准物质验证,最终获得准确的定性结果,具体流程如图1所示。1级质谱的获取准确检测离子峰的质荷比是质谱检测的目标,也是质谱定性的关键。分辨率的提高为质量精度的提高提供了基础。从统计学的角度,仪器的分辨率和质量准确度密切相关:质量误差(em)与检测化合物质荷比的质谱的分辨率(R)成反比,同时也与离子信号强度(S,假设只有信号噪声)密切相关。目前主要的质谱类型及其分辨率和质量准确度见表2。最新的15T的傅里叶变换离子回旋质谱(FT-ICR-MS)提供了目前最高的分辨率(10000000)和质量精度(<0.1×10-6(ppm)),但过慢的扫描速度导致难以与液相色谱尤其是超高效液相色谱联用,限制了其在组学研究中的应用。目前使用最普遍的是飞行时间质谱(TOF-MS)和轨道离子阱质谱(OrbitrapMS)。尽管OrbitrapMS可提供接近FT-ICR-MS的分辨率和质量精度,但其同位素峰丰度比的准确性较TOF和FT-ICR-MS差。数据依赖采集方式(data-dependent-acquisitionmode,DDA)是代谢组学中获取二级质谱的主要方式之一。但这种方式也有缺点,由于检测的是一级扫描中最强的几个峰,可能选择的是来源于源内裂解碎片或其他加和离子(如[M+Na]+),而不是关注的准分子离子[M+H]+。Matsuda等进行了多次重叠小窗口(每次检测60Da)的DDA实验以研究拟南芥的代谢物表达,获取了接近1600个质谱信号,基于获取的二级质谱定性了167种代谢物。另一种新的二级质谱获取方式称为MSE,在碎裂前母离子不进行筛选,采用离子的Pearson相关系数或泊松分布建模进行母离子和子离子关联,这种方法可以全面获取所有离子的二级质谱信息。2质谱条件的确定通常认为高质量准确度是确定化合物元素组成最重要的前提,精确质量数测定及分子式识别软件Massworks改变了只有高分辨率质谱才能测定精确质量的观念,应用谱图准确性的概念极大地提升了化合物分子式预测的准确性,即使单位质量分辨的四极杆仪器也可以使质量测定的准确度达到5×10-6(ppm)。要确定复杂体系中化合物分子式,高分辨的质谱仍然是不可或缺的。随着目标物质量数的增加,其可能的分子式也快速增多,即使质量准确度达到1×10-6(ppm),仍然无法获得理想的结果。例如,质量数为900,质量准确度为1×10-6(ppm)时可能的分子式达到345个。因此需要严格地限制条件以去除错误的结果。Kind和Fiehn确立了7条黄金法则用于分子式有效性的判断,除了其中的第7条只适用于GC-MS外,其他包括元素数量限制、LEWISSENIOR规则、同位素峰模式、其他元素与碳的比值等同样适用于LC-MS。不同元素的稳定同位素含量存在差异,相对分子质量相似的不同元素组成的物质,其M+1和M+2峰的相对丰度存在差异,因此同位素峰模式匹配对确定化合物的元素组成非常重要。Kind和Fiehn的研究结果表明,采用同位素峰模式匹配可以去除超过95%的错误分子式,采用3×10-6(ppm)的质量准确度结合2%的同位素丰度模式误差的检索结果优于单纯采用1×10-6(ppm)质量准确度的结果。在上述算法基础上,Pluskal等进一步利用MS/MS信息获得了更加准确的分子式确定结果。解决代谢物分子式确定的另一理想途径是采用同位素标记。在植物和微生物中常采用全13C标记,通过离子对的匹配获取准确的分子式。Giavalisco等应用上述技术在拟南芥中鉴定了超过1000种代谢物(分子式)。对于超高分辨率的质谱而言,确定分子式相对较为简单。因为不同元素的重同位素与其最高丰度的单同位素的相对分子质量差存在细微的差异:13C和12C的相对分子质量差为1.00335Da;17O和16O的相对分子质量差为1.00422Da;15N和14N的相对分子质量差为0.99703Da;2H和1H的相对分子质量差为1.00682Da;33S和32S的相对分子质量差为0.99939Da。图2为不同分辨率下牛磺胆酸的M+1峰:当质谱分辨率达到800000时,M+1中N、S、C、H的单重同位素峰获得良好的分离;分辨率达到2000000时,C和O的单重同位素峰也获得了分离。基于上述分离结果可较为简便地获取物质的分子式。3质谱数据库hmdb元素组成为化合物的分子结构提供了基础。但问题是随着相对分子质量的增加,可能的同分异构体数量迅速增加。更为简便合理的方式是检索已知的化学结构和天然产物数据库,去除大量不合理或不存在的同分异构体。以分子式C15H12O7为例,采用分子结构生成软件MOLGEN-MS进行预测,可能的分子结构达到78800个,但在KEGG数据库中匹配的化合物仅为3个。当然,这样做也存在风险,对于全新的化合物可能会得出错误的结果。近几年数据库发展飞速,代谢组学研究中常用的数据库(见表3)包括4种类型:(1)一般化学数据库(如PubChem),涵盖合成和/或天然的化合物;(2)代谢通路数据库(如BioCyc);(3)代谢物数据库(如人类代谢组数据库(HumanMetabolomeDatabase,HMDB));(4)质谱数据库(如NIST)。实际上,目前的许多数据库同时涵盖上述多个功能。HMDB是目前应用较为广泛的数据库,综合了大量的文献数据,包括在人体中发现的小分子代谢物的详细信息。HMDB数据库(Version3.5)收集了超过4万个内源性代谢物,以及与之相关的超过5000个蛋白质(DNA)信息。该数据库不仅可以提供临床化学数据以及外源数据库(如KEGG、Metlin、Biocyc等)的链接,而且还支持质谱图和核磁共振谱图的检索功能。谱图检索是质谱定性的常用方法,尤其在GC-MS数据上的应用较多。但对于液相色谱-质谱联用的二级质谱数据的谱图检索仍然存在较大的问题,因为所采用的仪器种类不同以及二级质谱采集参数的差异,均能导致二级质谱碎片种类及强度的巨大差异。目前HMDB、METLIN、NIST、MassBank等数据库提供电喷雾离子化(ESI)谱图检索功能,但在应用时需要注意:不同仪器类型甚至不同碰撞能都可能导致检索结果的差异;不同数据库的匹配得分计算方式也存在较大差异;检索过程是否考虑母离子的质荷比也存在不同,MassBank是检索所有谱图,METLIN有一个选项可确定母离子,而HMDB必须人为输入母离子质量窗口。仅依靠二级质谱所能获取的结构信息是有限的。如体液中磺基化、葡萄糖醛酸化的代谢产物和植物代谢物中的生物碱、皂苷类化合物等,通过二级质谱往往只能确定其类别,无法准确确定其分子结构,导致在组学研究中仍存在大量的代谢物无法获得准确鉴定。离子阱尤其是离子阱与高分辨质谱串联(如线性离子阱-轨道阱组合质谱联用仪(LTQ-Orbitrap))产生的多级质谱(MSn)提供了丰富的结构信息,在实际应用中可以鉴定更多的化合物。实际应用过程中有些同分异构体无法采用二级质谱进行准确区分,往往需要多级质谱进行稳健的区别。基于多级质谱的谱图树(spectraltrees)技术使基于质谱的代谢物的鉴定更加准确和稳健。LC-MS受扫描速度的限制,一般只能采集MS3,如果想获得多级的谱图树信息,就需要收集馏分,在nano-ESI下采用直接进样模式。RojasCherto等构建了549个代谢物的872个多级质谱信息数据库,建立了谱图树相似度计算方法,可进行谱图树检索,同时还比较了在线和离线状态下获取的谱图,表明不同采集模式下的谱图具有良好的重现性。4谱图的预测和分析谱图检索是处理代谢组学产生的大量质谱信息的重要手段,但数据库很难全面覆盖研究目标,而解析未知物质谱必须有质谱专家的参与。随着计算机技术的飞速发展,计算机辅助谱图解析技术得到了飞速的发展。化合物结构的碎裂有一定的规律,质谱专家就是基于这些规律对谱图进行解析的。质谱结构解析软件MassFrontier通过归纳和总结文献以及自有谱图库的数据构建了化合物碎裂的规则库,基于规则库可以对已知结构的化合物可能产生的碎片离子及其生成途径进行预测。基于碎裂规律的谱图预测的商品化软件还有ACD/MSFragmenter、MOL-GEN-MS等。断裂规律一般由质谱专家总结获得,但理论计算化学(如密度泛函理论,Densityfunctionaltheory,DFT)也可以对结构中可能的断裂位点进行预测。但软件所采纳的断裂规律不可能全面,另外对单一化合物而言并非所有规律都适用。Horai等采用ACD/MSFragmenter和MassFrontier对MassBank数据库中的453个代谢物进行了谱图预测,获得了12000个可能的离子碎片,只有3%的离子在实际谱图中得到了确证。目前代谢物的谱图库仍非常有限,许多已知化合物没有参比谱图,Hill等最先将谱图预测技术用于此类“已知的未知化合物”的鉴定。Wolf等构建的MetFrag也基于相同的途径:首先通过准确质量数在上游数据库(包括KEGG、Pubchem、ChemSpider等)中进行检索,获取候选化合物列表;然后根据断裂规律对候选化合物进行谱图预测,并通过预测谱图和实际谱图的对比对候选化合物进行评分和筛选。2008年,B9cker等提出采用碎片树(FragmentationTree,FT)来注释二级质谱图,图上的节点标示碎片的分子式,连接线标示中性丢失。碎片树的构建不需要分子结构的信息,碎片树是根据离子的分子式与常见的(中性、自由基)丢失列表,和质谱碎裂的规律相结合,自动判断二级质谱图中的离子之间的关联性,计算各个离子可能的生成途径。对比结果表明,基于二级质谱图的碎片树与多级质谱以及MassFrontier的结果对应很好。尽管碎片树结构非常类似于谱图树,但两者存在明显区别。碎片树是通过谱图库中已有的二级质谱计算得到的,而谱图树是通过多级质谱实验获得的,当然碎片树同样可以根据多级质谱的信息获取。相