大规模翻译后修饰蛋白质组学研究进展

大规模翻译后修饰蛋白质组学研究进展

翻译蛋白质后的精炼是指对基因功能的实现过程，它通过添加或添加氨基酸残基，或通过蛋白质水处理改变蛋白质的性质。短暂氨基酸处理不仅是“装饰”，还调节了蛋白质的活性状态、定位、折叠和蛋白质与蛋白质的相互作用。尽管蛋白质的翻译后修饰对生物功能的发挥有着至关重要的作用,但对它的规模化研究受到分析方法的限制,这很大程度上是由于翻译后修饰蛋白质的化学计量值低、复杂性大造成的.基因转录产物mRNA的可变剪接以及翻译中和翻译后修饰导致了基因产物的多样性,据预测,人类基因组包含大约30000个开放阅读框,平均每1个可阅读框可产生5~6个不同的mRNA,每1个mRNA翻译生成的蛋白质以不同的方式进行加工,每个多肽链大约可产生8~10种不同的修饰.目前,记录在册的翻译后修饰超过400种(/index.cfm/dm.home),仍有新的翻译后修饰被发现.同时,翻译后修饰还存在时空特异性,蛋白质的修饰类型及修饰程度随生物生存环境及内在状态的变化会表现出极大的差别,有的修饰甚至是转瞬即逝的,所以,蛋白质翻译后修饰的程度以及其生物学功能的挖掘还存在着极大的空间.面对纷繁复杂的翻译后修饰,应运产生了modification-specificproteomics:详细、系统地研究蛋白质翻译后修饰的蛋白质组策略.基于翻译后修饰蛋白质的不均一性及相对丰度低的特性,翻译后修饰蛋白质的研究主要是利用现有的蛋白质组学技术体系包括电泳、色谱、生物质谱以及生物信息学工具,对修饰蛋白质或肽段进行富集分离,消除修饰引起的不均一性并质量标记修饰位点,使之与理论质量有一个差异,通过质谱检测这种差异,从而鉴定蛋白质,并通过串联质谱鉴定修饰位点.其中存在的问题主要有两个:即翻译后修饰蛋白的富集分离问题和二级质谱的裂解效率问题.目前广泛使用的肽段裂解技术包括碰撞诱导解离(CID)和源后衰变(PSD)两种,某些翻译后修饰(如糖基化、磷酸化)在此条件下会优先断裂而使主链的裂解受到抑制,降低修饰位点的鉴定成功率.虽然翻译后修饰蛋白质组学技术条件还不完备,但是,随着蛋白质组表达谱研究技术的日益成熟和规模化,翻译后修饰蛋白质组学研究技术已经取得了可喜的进展.1磷酸化蛋白质组的分离富集蛋白质的磷酸化修饰是生物体内最重要的共价修饰方式之一.在人类蛋白质组研究中,据估计,超过50%的蛋白质发生过磷酸化修饰,估计有100000个潜在的磷酸化位点.目前,磷酸化蛋白质组的研究主要集中在真核生物体内普遍存在的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化.由于在生物体内磷酸化修饰蛋白质的含量非常低,因此在分析前必须要采取一定的分离富集手段.目前,磷酸化蛋白质的常用分离富集技术包括:金属亲和磷酸化蛋白质/磷酸化肽段(IMAC)、免疫沉淀、强阳离子交换色谱(SCX)、强阴离子交换色谱(SAX)、反相色谱等,这些技术被整合优化并应用于不同生物样本的磷酸化蛋白质组分析中.1.1全面研究丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的策略1.1.1分离步骤多的检测Beausoleil等测定了HeLa细胞的细胞核磷酸化蛋白质组.细胞核蛋白质经制备型SDS预分离后,胰酶酶切,在pH2.7下进行SCX分离,再经反相色谱、LCQ离子阱三级质谱鉴定,得到了2000多个磷酸化位点.用同样的技术路线研究胚胎鼠脑的磷酸化蛋白质组,鉴定了近500多个磷酸化肽段.虽然没有采用任何富集方法,此路线鉴定磷酸化肽段的能力却是惊人的;但是该方法仍有缺陷:含有超过2个碱性氨基酸残基的磷酸化肽段会与非磷酸化肽段共洗脱,无法被检测到;由于分离步骤多,所需样品量大;分离得到的馏分多,需要大量的分析时间.Gruhler等采用SCX和IMAC结合的方法对酵母信息素信号通路的磷酸化蛋白质进行研究,同时采用细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记对磷酸化蛋白质进行定量,LTQ-FTICR三级质谱鉴定得到了大约700个磷酸化肽.Collins等采用4条技术路线对小鼠的突触体磷酸化蛋白质组进行研究,其中一种路线采用两次固相金属亲和的方法.作者认为,双金属亲和的方法鉴定的磷酸肽具有互补性,可以检测到不同丰度范围和不同磷酸化状态的磷酸化蛋白质.文献、采用了IMAC-LC-MS/MS的技术路线进行磷酸化位点的鉴定,两者都对甲酯化反应进行优化,肽段经甲酯化反应处理后再进行IMAC亲和,并且均增大了亲和柱的柱床体积.在进行重复性实验时,两者均发现不同批次之间的覆盖率大约为60%.作者认为,未重复鉴定的肽段是由于质谱的扫描模式(information-dependentacquisitionmode)所限.在磷酸化蛋白质/肽段的富集方法中,IMAC是最频繁应用的方法,也是最行之有效的方法之一.但是,该方法仍有一定的缺陷:通过IMAC亲和,主要富集得到多电荷的磷酸化肽段,而且酸性较强的非磷酸化肽段会共洗脱.目前,酯化法以及二氧化钛亲和法已被发展用于降低亲和富集方法对酸性肽段的非特异性吸附.1.1.2磷酸化蛋白质的检测基于非液相色谱的磷酸化蛋白质组研究相对较少.Yamagata等结合二维电泳和磷酸酶对小鼠表皮纤维原细胞的磷酸化蛋白质进行观测.作者对电泳结果进行分析发现,1315个凝胶点中有63个点的位置向碱性端发生偏移.选择20个丰度较高的点进行Q-TOF鉴定,结果17个已有文献报道为磷酸化蛋白质.Hayduk等采用一种可专门针对磷酸化蛋白质进行染色的荧光染料Pro-QDiamond并结合双向电泳对中国仓鼠卵细胞的磷酸化蛋白质进行了观测,在1877个总蛋白点中“看”到了672个磷酸化蛋白质点,约占总蛋白质的36%.1.2酪氨酸磷酸化蛋白及抗体的选择在真核生物常见的三种磷酸化形式中,丝氨酸磷酸化最多,苏氨酸磷酸化其次,酪氨酸磷酸化最少,三者的比例约是1800∶200∶1.由于酪氨酸磷酸化抗体的选择性、特异性最好,因此,酪氨酸磷酸化蛋白质组的研究主要是基于抗体的高度灵敏性及特异性进行的.Salomon等采用酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀,结合甲酯化固相金属亲和色谱富集磷酸肽策略,研究了T细胞受体信号通路中的酪氨酸磷酸化蛋白质.同时,还研究了慢性骨髓性白血病细胞用STI571(Gleevec)处理后BCR-ABL信号通路中的蛋白质酪氨酸磷酸化位点的变化.Blagoev等结合多种蛋白质组学策略,对HeLa细胞酪氨酸磷酸化依赖的信号网络进行研究,作者采用精氨酸的3种稳定同位素形式对HeLa细胞进行代谢标记,对不同标记的细胞分别刺激不同的时间,再将细胞混合,用免疫沉淀的方法提取酪氨酸磷酸化蛋白质,酶解后的肽段进行LC/MS/MS分析.结果发现,共有81个蛋白质的酪氨酸磷酸化出现表达差异.Rush等通过酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀磷酸肽,与传统认为的磷酸化蛋白质抗体不适合富集磷酸化肽相悖,作者鉴定了多种瘤细胞中的总计688个酪氨酸磷酸化肽段,其中628个肽段有位点信息,这也是迄今鉴定细胞酪氨酸磷酸化最多的研究.由于丝氨酸、苏氨酸磷酸化抗体的特异性受空间位阻影响,其特异性远远不如酪氨酸磷酸化抗体,基于免疫亲和的丝氨酸、苏氨酸磷酸化研究较少.1.3质谱鉴定难在规模化的磷酸化蛋白质鉴定中,ESI-QTOF-MS、线性离子阱质谱仪使用较多.DeGiorgis等采用LCQ质谱仪,对磷酸化蛋白质肽段的二级质谱图进行了分析,并对出现的问题加以解析:1)大多数谱图包含强的中性丢失离子峰,但也有未出现中性丢失离子峰的谱图.这些谱图可能是非磷酸肽或酪氨酸磷酸肽对应的谱图.2)单电荷肽段离子未被鉴定到,仅有2个四电荷肽段离子被鉴定到,可能是由于单电荷肽段的二级谱图过于简单、四电荷肽段的二级谱图太复杂,以至于SEQUEST软件难以识别.3)在线性离子阱质谱中,由于气相β-消除反应的竞争,肽键不易断裂,导致一些谱图中虽有强的中性丢失离子峰,但没有足够的碎片离子峰进行磷酸化位点的指认.为了进一步对这些位点加以确认,作者又做了三级质谱,可能由于样品中多磷酸化肽段的丰度较高,三级谱图也出现同样的问题.Moser等比较了QSTAR(ESI-QTOF-MS)和LTQ(线性离子阱)两种质谱仪,认为QSTAR比LTQ更适合磷酸肽的序列分析.一方面由于QSTAR的高压、高碰撞效率的内腔,肽段裂解效率更高,更易发生中性丢失峰,另一方面由于飞行时间质量分析器的高分辨、高质量精确度,利于电荷状态的确认,减少假阳性.然而,由于LTQ的采集速率很高,而且可以做三级质谱,在一定程度上可弥补自身的缺点.在进行质谱鉴定时,磷酸化位点的指认困难是一个常见问题,这可能是由于软件没有考虑β消除反应产生的新型离子的存在.2糖基化的不均一性根据氨基酸和糖链的连接方式不同,蛋白质糖基化可分为4类:N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖化和聚糖磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor)糖基化.蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性,即不同的糖链可连于同一位点以及在同一蛋白质上也可有不同的位点连接不同的糖链.糖基化的不均一性给糖蛋白质的分离分析带来了很大的困难:不同糖型的同一蛋白质会在电泳上呈现弥散的条带,导致信号分散,较低丰度的蛋白质得不到鉴定;造成糖蛋白质在色谱中不能良好的分离;在质谱上表现为一簇分辨率很差的峰,得不到准确的分子量.鉴于此,当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系,分离富集糖蛋白质/糖肽,消除糖基化的不均一性及其对质谱的影响,质量标记糖基化位点,从而扬长避短,实现大规模高通量糖蛋白质及糖基化位点的鉴定.目前,常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、β消除麦克尔加成反应.基于质谱的糖蛋白质鉴定及糖基化位点确定方法有:PNGaseF酶法、EndoH酶法、β-消除麦克尔加成反应、三氟甲基磺酸法.后两种方法未见用于规模化糖蛋白质分析的相关报道.2.1凝集素亲和技术基于糖蛋白质本身的复杂性,在糖蛋白质组的研究中必须运用多元化的技术和策略.Hagglund等在对人血浆糖蛋白质进行研究时采用凝集素亲和与亲水相互作用色谱相结合的方法,EndoH酶法切糖,从而在N-糖基化位点处留下GlcNAc起到质量标记的作用,用ESIQ-TOF质谱鉴定得到37个蛋白质的67个糖肽.Bunkenborg等采用两步凝集素亲和的方法分别富集糖蛋白质和糖肽,采用PNGaseF酶法使天冬酰胺转变为天冬氨酸,造成质量数增加0.98Da,用LCQ离子阱质谱鉴定出人血清中77个糖蛋白质中86个糖基化位点.Kristiansen等把凝集素亲和法与一维凝胶电泳相结合对人胆汁进行研究,在使用PNGaseF进行切糖时,采用18O的水进行标记,造成质量数增加3Da,这种方法减少了由于自发脱氨基带来的假阳性.Liu等在对人血浆N-糖蛋白质进行研究时,先采用免疫亲和的方法去除血浆中的高丰度蛋白质,再用肼化学法富集糖基化蛋白质,柱内酶解蛋白后,使用PNGaseF释放N-糖肽,经SCX分离,通过反相毛细管色谱-LTQ离子阱串联质谱对糖肽进行分析.同时,作者采用FTICR对鉴定的糖基化位点的可靠性进行评估,总共鉴定了303个N-糖蛋白质的2053个N-糖肽,有639个N-糖基化位点被确认.目前,凝集素亲和技术是糖蛋白质组学中应用最广的分离富集技术,肼化学法由于其高特异性也受到越来越多的关注,上述报道也是目前肼化学法应用最成功的例子.2.2糖基化离子标记对于O-糖蛋白质来说,现在还没有一种能与N-糖蛋白质研究中应用的PNGaseF相比的一种酶用以实现去糖基化及质量标记糖基化位点,因而O-糖蛋白质组学的研究鲜有报道.Khidekel等采用体外标记方法将一个带有酮基的UDP-半乳糖特异地连接到O-GlcNAc上,然后利用酮基的反应性与生物素连接,进而通过抗生物素蛋白富集糖基化蛋白质.这种标记方法不依赖于生物体自身代谢途径,大大扩展了方法的适用范围,用这种方法Khidekel等从鼠脑中鉴定了25个O-GlcNAc化蛋白质.Vosseller等采用凝集素弱亲和色谱的方法对鼠脑突触后密集区的O-GlcNAc蛋白质进行研究,通过凝集素对O-GlcNAc肽段的弱亲和作用,延长了对含O-GlcNAc肽段的保留时间,其实质相当于离子交换色谱的作用,与高效液相色谱连用,ESI-QqTOF-MS鉴定了63个O-GlcNAc肽段.该方法的优点是可直接富集体内的O-GlcNAc化蛋白质,无需对糖基化位点进行化学或酶解标记的改造,方法简单.同时,作者还采用了电子捕获裂解(electroncapturedissociation,ECD)对O-GlcNAc化位点进行分析.这也是目前ECD首次运用于复杂样品的修饰位点分析,共鉴定了12个O-GlcNAc化位点.ECD是存在于傅立叶转换离子回旋共振质谱仪中的新型蛋白/肽段裂解方式,在ECD条件下,翻译后修饰甚至非公价键维系的二级结构都可保持稳定,使得ECD成为非常有前途的翻译后修饰研究工具.2.3gpi-aps的制备聚糖磷脂酰肌醇锚定蛋白质(Glycosylphosphatidylinositol-anchoredproteins,GPI-APs)是由聚糖磷脂酰肌醇基团共价连接于蛋白质的C末端形成,由于锚定于脂双层而具有固有膜蛋白质的一些物理化学特性.对GPI-APs的主要研究方法是采用“shave-and-conquer”的策略,该方法采用两相分离法,在溶有细胞膜的有机相中加入磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC,phosphatidylinositolphospholipaseC)水解磷脂酰肌醇,GPI-APs被释放而溶入水相,结合一维或二维凝胶电泳分离、免疫印迹检测、液相色谱-串联质谱对蛋白质进行鉴定.Borner等同时采用差减蛋白质组学的策略,对经PI-PLC处理和未经PI-PLC处理的样品的水相蛋白质进行二维荧光差示凝胶电泳分离,由于污染蛋白质在2个组分中共同存在,将相同的蛋白质剔除后便得到纯的GPI-APs.3gly-gly串联质谱鉴定泛素化位点泛素是由76个氨基酸组成的多肽,高度保守,可通过异肽键与靶蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基共价连接.从酵母到哺乳动物,泛素化都是细胞蛋白质降解和功能调控中非常重要的调控机制,重要性甚至可以与磷酸化相当.对泛素化修饰的研究应包括以下几个方面:1)哪些蛋白质被泛素化修饰?2)泛素结合在蛋白质的什么位点?3)自然发生的多聚泛素化链中泛素-泛素结合位点在哪里?4)泛素-蛋白酶系统:鉴定调节泛素和类泛素系统的酶体系构成.对泛素化蛋白质富集主要是基于标记法进行的,即对泛素进行亲和标签标记(常用6xHis),再采用镍螯合色谱亲和提取泛素化蛋白质.由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly结构,经胰蛋白酶水解后,Gly-Gly留在被修饰蛋白质的肽链上,使肽段质量增加114,起到质量标记泛素化位点的作用,进而通过串联质谱鉴定泛素化位点.Peng等运用此方法,再结合SCX、RP-LC分离泛素化肽段,通过LCQ串联质谱鉴定酵母中的1075个泛素化蛋白质,110个泛素化位点.这种方法已经被延伸运用到了哺乳动物体系的泛素化研究中.近来,基于双亲和策略的富集方法频繁出现,Mayor等采用多聚泛素结合柱与镍螯合色谱相结合,对酵母中Rpn10依赖的泛素化蛋白质进行鉴定;Tagwerker等则采用基于双标记的双亲和富集策略,对泛素基团进行六组氨酸标签标记和生物素标签标记,然后依次采用镍螯合色谱、链霉抗生物素蛋白亲和提取泛素化蛋白质,同时针对富集方法中链霉抗生物素蛋白的紧密折叠特性采用两步酶解的方法(Lys-C、trypsin)从柱上洗脱、酶解泛素化蛋白质,结合SCX、RP-LC色谱分离,QSTAR质谱鉴定到258个泛素化蛋白质.目前,对泛素蛋白的研究已从真核细胞体系延伸到哺乳动物体系中,对泛素的标记方法也有所发展,像璜酸化,现在该方法还停留在标准蛋白的试验阶段,在规模化的泛素化蛋白鉴定中的应用还未见报道.对泛素自身的修饰位点的研究.目前,在酵母体系中,基于鸟枪法的大规模泛素化蛋白质的研究已经表明,泛素中的7个赖氨酸侧链均可形成多聚泛素链,以质谱为基础的蛋白质组学开始为多聚泛素链的分析提供一种直接的可定量的方法.多蛋白复合体以及蛋白质-蛋白质相互作用在泛素-蛋白酶体系中承担了重要的角色,运用亲和纯化与质谱相结合的方法,多种细胞和组织中的去泛素化蛋白酶已被鉴定,并且鉴定出许多新的去泛素化系统成员.总之,现有的泛素化蛋白规模化研究方法很少,且种类单一,鉴定细胞蛋白的泛素化底物,泛素化位点及泛素自身的修饰位点,还需要有重大的技术上的进步.除了泛素化修饰之外,还发现了一大家族——类泛素化修饰.类泛素化与泛素化具有显著的序列同源性,许多情况下通过相似的机制形成蛋白质的共价修饰.目前,许多与泛素化修饰相似的研究方法运用到了Sumoylation(类泛素化修饰的一种)的研究中.4蛋白质功能的长期丧失活性氧和氮类可以对特定蛋白质进行各种各样的化学修饰,如果这种修饰是不可逆的,则经常与蛋白质功能的永久丧失相关,可以导致损害蛋白质的消除或积累;可逆修饰,特别是发生在半胱氨酸残基上的,可以起到保护半胱氨酸避免发生不可逆氧化修饰和调节蛋白功能的双重作用.在这里,我们对已有的基于蛋白质氧化还原状态进行研究的蛋白质组学进行介绍.4.1酪氨酸硝化抗体一般说来,硝化是在酪氨酸残基的酚环的3位上加上1个硝基(—NO2),是细胞内过氧化亚硝酸根离子(—ONOO-)形成的结果.目前,大部分的酪氨酸硝化的蛋白质组研究是在某种刺激条件下,以酪氨酸硝化抗体为基础进行的.Aulak等研究与炎症相关的硝化蛋白质,采用二维电泳与免疫印迹相结合的方法,MALDI-TOF-MS鉴定了40多个酪氨酸硝化免疫阳性的蛋白质,其中10多个已被鉴定过.Kanski等采用连续的溶液等电聚焦进行样品体系的简化,再对粗分离的组分进行SDS分离、免疫印迹检测,目标蛋白质经LC-LCQ串联质谱分析鉴定出11个硝化蛋白质.4.2f间基本思想S-亚硝酰化,也叫做S-亚硝化,是在硫原子上加上一个亚硝基双原子基团(—NO).对S-亚硝酰化蛋白质的研究策略主要是以“biotin-switch”方法为基础的,该方法最早由Jaffrey等提出,大致包括以下几个步骤:(1)封闭所有自由巯基;(2)选择性还原S—NO键;(3)还原产生的新的自由巯基通过形成杂和的二硫键引入生物素标签,从而对蛋白质进行了质量标记以及亲和标记;(4)通过固相的抗生物素蛋白富集目标蛋白质.这种方法克服了直接对亚硝化蛋白质进行分析时产生的易变性,避免了进行质谱鉴定时产生的S—NO的断裂.许多研究运用这种方法与一维凝胶电泳或二维凝胶电泳相结合,再通过质谱鉴定发生亚硝酰化的蛋白质.Hao等对该方法进行了发展,先用胰酶把蛋白质酶解再进行抗生物素蛋白富集,然后结合液相色谱-串联质谱进行蛋白质鉴定.4.3谷胱甘肽酶活性蛋白的检测谷胱甘肽化(glutathionylation)即谷胱甘肽(GSH)在谷氧还蛋白酶的催化下与蛋白质的半胱氨酸形成二硫键,该过程是可逆的.Lind等采用与S-亚硝酰化相似的分析方法,在生物素标记蛋白富集前对蛋白进行酶解,富集谷胱甘肽化肽段,从而鉴定到发生修饰的位点.人们发现,日本裂体吸虫分泌的谷胱甘肽-S-转移酶可以结合S-谷胱甘肽化蛋白的谷胱甘肽簇.基于此,Cheng等将谷胱甘肽-S-转移酶用生物素标记后,采用一种类似免疫印迹的方法检测谷胱甘肽化蛋白,这为谷胱甘肽化蛋白质的检测提供了一种简便易行的方法.由于S-亚硝化谷胱甘肽(GSNO)也是一种GS-供体,可以与蛋白质形成杂和的二硫键,因而Klatt等把GSNO与琼脂糖凝胶相结合,通过GSNO柱来结合目标蛋白质,但这种方法不能反映体内实际发生谷胱甘肽化修饰的蛋白质情况,只能检测那些易受谷胱甘肽化影响的蛋白质.4.4氧化还原修饰的探索半胱氨酸在氧化条件下可形成二硫键、亚氧硫基(—SOH)、亚硫酸基(—SO2H)、硫酸基(—SO3H),其中亚硫酸基和硫酸基是半胱氨酸的不可逆氧化形式,可能与生物活性的丧失有关.为了系统地研究细胞的氧化还原调节,Yano等采用硫醇特异的荧光标记,并结合两种类型的双向电泳(non-reducing/reducing2-DE和IEF/SDS),成功鉴定到花生中受硫氧还蛋白调控的20多个蛋白.Lee等对一种植物中含有二硫键的蛋白质进行了研究,采用硫醇亲和色谱富集目的蛋白,共鉴定到65个公认的含二硫键的蛋白.Moan等则采用双标记的方法对啤酒酵母中的硫醇氧化蛋白分别进行富集和定量,总共质谱鉴定了64个蛋白质.总之,对氧化还原修饰的研究还处于初始阶段,大部分的研究工作是基于MALDI-TOF的蛋白质鉴定,对修饰位点的研究很少.相信随着科学家们越来越多的关注,会有更多更有效的方法出现,从而能更深刻地理解氧化还原修饰的功能.5蛋白质类型其它修饰像乙酰化、甲基化、脂基化也有报道,但并不多见.Ong等采用免疫沉淀方法,同时结合细胞培养过程中的稳定同位素标记氨基酸(stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,SILAC)对甲基化修饰进行定量,鉴定得到了59个甲基化位点.Iwabata等采用二维电泳与免疫印迹结合的方法对鼠脑、骨骼肌的赖氨酸甲基化、赖氨酸乙酰化进行分析,发现不同器官的赖氨酸甲基化、乙酰化的蛋白质类型有很大差别.MacCoss等采用鸟枪法与多维蛋白质鉴定技术(multidimensional