大鼠肠内5个黄酮苷成分的肠吸收研究

大鼠肠内5个黄酮苷成分的肠吸收研究

绵羊和艾灸包括具有特殊结构的黄酮类化合物。它们在八个母核上替换异戊基。主要代表性成分有润羊茅素、朝伦a、朝伦b、朝伦c和宝胃素。文献报道淫羊藿黄酮苷对心脑血管系统、骨代谢、免疫系统及性机能等方面具有广泛的药理功效,但药物动力学研究表明,此类成分的生物利用度较低,口服吸收情况较差。作者曾应用Caco-2细胞模型从体外对淫羊藿黄酮苷的吸收转运机制进行了探讨,结果表明淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的吸收渗透系数(PAB值)都较小,说明这类成分的肠道吸收较差,原因可能是存在肠道转运蛋白的外排机制,并且单糖苷(宝藿苷Ⅰ)的吸收大于二糖苷(淫羊藿苷),二糖苷的吸收大于三糖苷(朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)的吸收。本研究将应用大鼠在体肠灌流模型对淫羊藿黄酮苷的在体吸收代谢的方式进一步深入探讨,以全面阐释淫羊藿黄酮苷的吸收代谢情况。1材料表面1.1实验动物及许可证雄性SD大鼠150~170d,体重250~300g,由中国科学院上海实验动物中心提供,动物许可证号SCXK(沪)2002-0010。1.2化法测定淫羊藿苷(批号110737-200312,供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ由江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供,纯度经归一化法测定均大于98%。睾丸酮(浙江仙居县化工药剂厂,批号060711513,纯度>98%)。氯化钙(上海市奉贤奉城试剂厂,批号060427);硫酸镁,氯化钾(无锡市民丰试剂厂,批号051107,060318);磷酸二氢钾,磷酸氢二钠(南京化学试剂一厂,批号06081587,06055015);葡萄糖(河北葡萄糖厂,批号060603);碳酸氢钠(南京化学试剂有限公司,批号060310177);HEPES(北京拜尔迪生物公司,批号060811571);乙腈,冰醋酸(色谱纯,Merck),其他试剂均为分析纯。1.3lertoldo分析Agilent1100高效液相色谱仪,四元泵,DAD检测器(Agilent科技公司,美国);METTLERTOLEDO分析天平,(METTLERTOLEDO分析仪器有限公司);Anke离心机TGL-16G,(上海安亭科学仪器厂);数显恒温搅拌循环水箱HH-60(常州国华仪器厂);恒流泵PHD2000Infuse/withdrawpump(HarvardApparatusInc.美国)。2方法和结果2.1不同浓度的淫羊茯苓黄酮苷及其储备液的配制HBSS溶液的配制:精密称取NaHCO30.37g,HEPES5.96g,D-glucose4.5g,CaCl2·2H2O0.185g,MgSO40.1g,KCl0.4g,NaCl18g,KH2PO40.06g,Na2HPO40.05g,加水稀释至1L,用5mol·L-1NaOH调节pH7.4。淫羊藿各黄酮苷储备液的配制:分别精密称取淫羊藿苷6.76mg,朝藿定A8.38mg,朝藿定B8.08mg,朝藿定C8.22mg,宝藿苷Ⅰ5.14mg,分别先加入2mL二甲亚砜使其溶解,再分别加入8mL无水乙醇混匀,配制成1mmol·L-1的淫羊藿各黄酮苷储备液,备用。10μmol·L-1各淫羊藿黄酮苷小肠灌流液的配制:分别精密吸取各淫羊藿黄酮苷储备液2.5mL置250mL量瓶中,用37℃的HBSS溶液稀释定容,配制成浓度为10μmol·L-1的各淫羊藿黄酮苷小肠灌流液。内标溶液的配制:精密称取睾丸酮14.4mg,加乙腈溶解定容至5mL,即配制成10mmol·L-1的储备液。精密吸取睾丸酮储备液0.1mL,加入9.4mL乙腈与0.6mL冰醋酸,混合均匀,即为100μmol·L-1内标液,备用。2.2感染小鼠模型肌肉注射50%乌拉坦溶液(2.3mL·kg-1)对大鼠麻醉,待麻醉后打开腹腔,在十二指肠、空肠、回肠和结肠两端插管,用线缝合好,每段肠段长约10cm。插管后将小肠部分小心放回腹腔,尽可能避免卷曲和扭结。切口用生理盐水浸润的纱布覆盖。用灌流泵将含有药物的溶液同时灌入四段肠段,泵的流速为0.2mL·min-1,30min达到吸收平衡后,每隔30min收集4份出口管中样品,供HPLC检测。2.3样品处理取肠灌流收集样品400μL,加入100μL内标溶液与之混合,离心,取上清液,即得。2.4流动相乙腈柱温度2.4.1色谱条件ZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm,5μm),流速1mL·min-1,检测波长268,245nm,流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱,0~11min:29%A,13min:70%A,19min:80%A,22min:100%A,柱温30℃。HPLC图见图2。2.5实验结果的计算测定灌流液中药物的消失速率来测定灌流液中药物的摄取,用消失速率来计算肠壁的渗透系数P∗effeff*。P∗effeff*=(1-Cm/Co)/4GzCo和Cm代表进口浓度和出口浓度,Gz与流速,肠子的长度,扩散系数有关,把实验数据代入公式,用设计的Eexcel表计算。经SPSS10.0统计软件进行统计。3各肠段的渗透系数10μmol·L-1淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ在大鼠不同肠段的吸收存在差异,表观渗透系数均显著低于十二指肠和空肠肠段结果(表1)。结果表明淫羊藿苷在十二指肠的渗透系数与空肠比较有显著性差异(P<0.05),十二指肠、空肠的渗透系数与回肠、结肠比较有显著性差异(P<0.05),而回肠与结肠比较无显著性差异。从各肠段的HPLC图可以看出,淫羊藿苷在各肠段有2个代谢产物,而且在十二指肠、空肠较多,回肠较少,结肠最少,有时观察不到。对于朝藿定A和朝藿定C,十二指肠、空肠之间、回肠、结肠之间的渗透系数均无显著性差异,但十二指肠、空肠的渗透系数与回肠、结肠的渗透系数均有显著性差异(P<0.05)。对于朝藿定B,十二指肠、空肠之间的渗透系数、回肠、结肠之间的渗透系数均有显著性差异(P<0.05),并且十二指肠、空肠的渗透系数分别与回肠、结肠的渗透系数比较均有显著性差异(P<0.05)。和淫羊藿苷相似,朝藿定A,B,C在大鼠肠道各自有1个代谢产物。宝藿苷在大鼠肠道的吸收代谢与淫羊藿苷不同,HPLC图显示它在肠道没有代谢产物,直接被吸收,且在4个肠段都有一定量的吸收。4肠道黏膜表面水解酶的代谢产物从实验数据与HPLC图分析,淫羊藿黄酮苷的肠道吸收代谢与其化学结构与肠黏膜上皮上的酶密切相关。由HPLC图可知,药液灌流后,淫羊藿苷,朝藿定A,B,C在十二指肠、空肠部位原型化合物色谱峰明显减小,而在原型化合物色谱峰之后出现1~2个较明显的色谱峰,经紫外光谱比对,其紫外光谱与淫羊藿苷相同,确认为淫羊藿苷,朝藿定A,B,C的代谢产物,又由于代谢产物峰的保留时间比原型大,即代谢产物的极性应比原型小,因此排除代谢产物是二相代谢产物的可能。文献报道,在人和大鼠的肠道存在着水解酶,如LPH酶、β-糖苷酶能水解黄酮苷等成分,因此淫羊藿苷等成分也可能会在肠黏膜表面被水解,而产生代谢产物。朝藿定A,B,C均为三糖苷,淫羊藿苷为二糖苷,宝藿苷为单糖苷。三糖苷朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C由于它们的结构相似,母核相同,都为异戊烯基黄酮,7位连接1个葡萄糖,只是3位连接的双糖有区别,分别为鼠李糖-葡萄糖,鼠李糖-木糖,鼠李糖-鼠李糖,因此它们吸收代谢的途径也非常相似,在肠道各有1个代谢产物,文献报道LPH酶可以水解葡萄糖,因此朝藿定A,B,C的代谢产物可能是7位上的葡萄糖被水解后产生的次苷。单糖苷宝藿苷Ⅰ3位连接1个鼠李糖,在肠道没有代谢产物,说明3位的鼠李糖不易被水解形成苷元,二糖苷淫羊藿苷7位连接1个葡萄糖,3位连接1个鼠李糖,在肠道有2个代谢产物,其中7位的葡萄糖易被水解而产生次苷,而3位的鼠李糖是否被水解,有待进一步证明,这也说明大鼠肠黏膜表面水解酶对化合物的水解是有结构选择性的。总之,淫羊藿黄酮在大鼠肠道吸收的过程十分复杂,淫羊藿苷,朝藿定A,B,C的渗透系数应该是1个表观渗透系数