独活提取物i在大鼠体肠灌流中的肠吸收性质研究

独活提取物i在大鼠体肠灌流中的肠吸收性质研究

在口药物制剂的处方之前的研究中，有必要研究药物在口服后的体内吸收部位和情况。小肠是大多数药物主要的吸收部位,预测药物小肠吸收的方法有离体和在体法。在体法因不损伤研究部位的淋巴和循环系统而明显优于离体法。其中大鼠肠单向灌流法(SPIP)能很好地模拟人体的体内环境,且结果与人体的试验结果相关性良好,目前在国内外得到了广泛的应用。独活为常用中药,始载于《神农本草经》,药理试验有镇痛、镇静和收缩血管的作用。临床上主要用于治疗风寒湿痹,腰膝疼痛,少阴伏风头痛等。独活的有效成分为香豆素类,包括二氢欧山芹醇乙酸酯(columbianetinacetate),蛇床子素(osthol),二氢欧山芹醇当归酸酯(columbianadin),二氢欧山芹醇(columbianetin)等,主要是以单味或复方用药。研究口服中药活性成分的吸收部位和吸收机制对建立口服药物传输系统和理解中药作用的物质基础具有重要意义。本文采用不同工艺分别制得独活提取物I(总香豆素含量<10%)和独活提取物II(总香豆素含量≥60%),重点研究独活提取物I中3种有效成分(二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯)在体单向灌流肠吸收特性,考察此3种有效成分在不同吸收部位和不同浓度条件下的小肠吸收情况,并比较独活提取物I和独活提取物II中3种成分在结肠中的吸收。对照品贮备液的制备仪器LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津分析仪器公司);SPD-10A紫外检测器(日本岛津分析仪器公司);1-15K高速冷冻离心机(Sigma公司);N-2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息研究所);HL-2电子蠕动泵(上海沪西分析仪器厂);ZNHW-III电子节能控温仪(巩义市英峪予华仪器厂)。药品与试剂二氢欧山芹醇乙酸酯对照品(自制,纯度>98.7%);蛇床子素对照品(自制,纯度>98.8%);二氢欧山芹醇当归酸酯对照品(中国药品生物制品检定所,纯度>99%);独活药材(徐州彭祖中药饮片有限公司);甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。Krebs-Ringer’s灌流液组成:NaCl(133mmol·L-1),KCl(4.7mmol·L-1),CaCl2(3.3mmol·L-1),MgCl2(2.3mmol·L-1),NaH2PO4(1.8mmol·L-1),NaHCO3(16.4mmol·L-1),D-葡萄糖(7.8mmol·L-1)。动物SD大鼠,雄性,体重250~300g,中国药科大学实验动物中心。独活提取物I和独活提取物II的制备独活提取物I的制备:独活药材粉碎,过20目筛,4倍量95%乙醇提取2h,反复提取3次,合并提取液,减压回收溶剂,得独活提取物I。独活提取物II的制备:取独活提取物I10g,进一步精制纯化得独活提取物II。色谱条件C18色谱柱(250mm×4.6mmID,5μm);流动相:甲醇-水(70∶30,v/v),流速:0.6mL·min-1(1~15min),1.0mL·min-1(15~35min);进样量:20μL;柱温:25℃;检测波长:325nm。标准曲线的绘制独活提取物I分析用标准曲线的绘制:精密称取二氢欧山芹醇乙酸酯对照品1.4mg,蛇床子素对照品3.1mg,二氢欧山芹醇当归酸酯对照品1.2mg,置10mL量瓶中,甲醇定容,即得对照品贮备液(I)。精密量取对照品贮备液(I)适量,用甲醇稀释成不同浓度的系列溶液,精密吸取系列溶液各200μL,置于10mL离心管中,分别精密加入Krebs-Ringer’s灌流液1.3mL,乙醚1.5mL,涡旋2min,4000r·min-1离心10min,吸取上层液,反复操作3次,合并上层液,氮气吹干,精密加入甲醇200μL,涡旋1min,离心(10min,13500r·min-1),取上清液20μL进行高效液相色谱分析,分别以3种对照品的质量浓度(C,μg·mL-1)对峰面积(A)进行线性回归,得3个标准曲线方程。独活提取物II分析用标准曲线的绘制:精密量取二氢欧山芹醇乙酸酯对照品1.4mg,蛇床子素对照品3.1mg,二氢欧山芹醇当归酸酯标准品1.2mg,置10mL量瓶中,加入5mL无水乙醇和5mL10%吐温乙醇液溶解,Krebs-Ringer’s灌流液定容至100mL,摇匀,即得对照品贮备液(II)。精密量取对照品贮备液(II)适量,用阴性溶液(取无水乙醇5mL和10%吐温乙醇液5mL,Krebs-Ringer’s灌流液定容至100mL,混匀,即得)稀释成不同浓度的系列溶液,离心(10min,13500r·min-1),取上清液20μL,进行高效液相色谱分析,同上得到3个标准曲线方程。样品溶液的配制独活提取物I灌流液:精密称取一定量的独活提取物I,加入Krebs-Ringer’s灌流液定容至200mL,即得。独活提取物II灌流液:精密称取一定量的独活提取物II,无水乙醇5mL溶解,再加入10%吐温乙醇液5mL,Krebs-Ringer’s灌流液定容至100mL,500r·min-1密封搅拌10min,即得。空白肠灌流液:Krebs-Ringer’s灌流液适量,按以下“大鼠在体肠吸收实验”方法灌流,收集流出液,即得。肠循环液中3种有效成分浓度的测定独活提取物I中3种有效成分质量浓度的测定:在不同时间点的大鼠在体肠单向灌流液样品中分别加入乙醚1.5mL,涡旋2min,4000r·min-1离心10min,吸取上层液,反复操作3次,合并上层液,氮气吹干,加入甲醇200μL,涡旋1min,高速离心(10min,13500r·min-1),取上清液20μL,进行高效液相色谱分析,将得到的药物峰面积代入相应的药物标准曲线方程,计算药物的质量浓度。独活提取物II中3种有效成分质量浓度的测定:将不同时间点的大鼠在体肠单向灌流液样品离心(10min,13500r·min-1),取上清液20μL,进行高效液相色谱分析,将得到的药物峰面积代入药物标准曲线方程,计算药物的质量浓度。回收率独活提取物I回收率:精密量取已知3种成分含量的独活提取物I3份,分别加入不同浓度的3种对照品溶液适量,得到含3种有效成分对照品的低、中、高3个浓度的溶液,按照“独活提取物I中3种有效成分浓度的测定”方法处理,进行高效液相色谱分析,将得到的药物峰面积代入相应的药物标准曲线方程,计算药物的质量浓度及回收率(n=5)。独活提取物II回收率:精密称取已知含量的独活提取物II3份,加入3种有效成分对照品适量,得对照品含量分别为低、中、高的样品,无水乙醇5mL溶解,再加入10%吐温乙醇液5mL,空白肠灌流液定容至100mL,500r·min-1密封搅拌10min,高速离心(10min,13500r·min-1),取上清液20μL,进行高效液相色谱分析,将得到的药物峰面积代入相应的药物标准曲线方程,计算药物的质量浓度及回收率(n=5)。药物稳定性考察分别精密称取独活提取物I、II3和0.15g,按“样品溶液配制”法配制独活提取物I灌流液和独活提取物II灌流液,密封,置37℃恒温水浴中,分别于0、30、60、90和120min测定3种有效成分含量。大鼠在体肠吸收实验取SD大鼠禁食过夜(自由饮水),0.2g·mL-1乌拉坦溶液麻醉(5mL·kg-1),固定,用红外灯保持37℃体温,沿腹中线打开腹腔约3cm,对考察的肠段于两端切口后,插管并结扎。用37℃恒温的生理盐水以5mL·min-1的速度将肠内容物冲洗干净,再用空气将生理盐水排空,装好装置。取预热至37℃的供试药液100mL,以0.1mL·min-1的流速灌流30min,收集流出液并开始计时,每隔15min分段收集流出液,并精确量取流出液重量。实验共收集6次流出液。实验结束后,测量肠段长度与内径。实验考察的分段肠段区间均取约10cm,十二指肠段为距幽门1cm处开始取10cm;空肠段为距幽门15cm处开始取10cm;回肠段为盲肠上20cm处开始取10cm;结肠段为紧邻盲肠处开始取10cm。数据分析实验中小肠不仅吸收药物也吸收和分泌水分,导致供试液体积变化,故不能用直接测定药物浓度的方法计算药物的吸收。本文采用重量分析法对灌流液的流入和流出的体积进行校正,消除其体积变化的影响,按下列方程式计算吸收速率常数(Ka)和表观吸收系数(Papp)。Ka=(1-CoutQout/CinQin)Q/VPapp=[-Qin·ln(CoutQout/CinQin)]/2πrl式中:Qin和Qout分别为肠道进、出口灌流液的流速(mL·min-1);Cin、Cout分别为肠道进、出口灌流液的浓度(μg·mL-1);Q为灌流速度(mL·min-1);l和r分别为被灌流肠段的长度和内径(cm);V为灌流肠段的体积(cm3)。利用统计分析软件SPSS13.0处理肠吸收数据,并进行方差分析。结果1回归模型的建立由图1可见,二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯的保留时间分别约为14、27和30min,各成分峰分离良好,空白肠灌流液中的物质对药物的测定无干扰。独活提取物I中二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素及二氢欧山芹醇当归酸酯的回归方程分别为C=3E-05A+0.1767(r=0.9998)、C=4E-05A+0.7277(r=0.9999)及C=7E-05A+0.2007(r=0.9999)。独活提取物II中3种有效成分的回归方程分别为C=4E-05A+0.5887(r=0.9997)、C=6E-05A-3.8774(r=0.9996)及C=8E-05A-1.5577(r=0.9999)。3种有效成分的线性范围分别为:1.4~140、3.1~310和1.2~120μg·mL-1。独活提取物I样品用上述HPLC方法测得二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量分别为1.33%、2.00%和0.42%。独活提取物II中二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量分别为10.21%、62.20%和1.01%。2药物稳定性的研究提取物I和提取物II在灌流液中药物稳定性试验结果见表1,表明药物在37℃灌流液中120min内稳定。3体肠吸收实验分别精密称取独活提取物I1、3和9g,Krebs-Ringer’s灌流液定容至200mL,制得低、中、高3个浓度的独活提取物I灌流液,进行十二指肠段灌流,按“大鼠在体肠吸收实验”方法进行考察。吸收参数见表2,结果表明二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯的质量浓度分别在62~555、101~887和19~186μg·mL-1,同种成分的Ka和Papp均无显著差异,说明药物吸收无自身浓度抑制作用,符合Ficks扩散原理,提示二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯的小肠吸收表现为被动扩散吸收机制。4不同肠段同糖对pahs的影响精密称取独活提取物I3g,Krebs-Ringer’s灌流液定容至200mL,制得独活提取物I灌流液,分别进行十二指肠段、空肠、回肠和结肠灌流,按“大Thelow,middleandhighconcentrationsofcolumbianetinacetatewere62,165and555μg·mL-1,respectively.Thelow,middleandhighconcentrationsofostholwere101,287and887μg·mL-1,respectively.Thelow,middleandhighconcentrationsofcolumbianadinwere19,52and186μg·mL-1,respectively鼠在体肠吸收实验”方法分别进行考察。吸收参数见表3,结果表明在不同肠段同种成分的Ka、Papp是结肠>十二指肠>空肠>回肠,且结肠的Ka、Papp显著大于其他肠段(P<0.05);说明二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯在整个肠段均有吸收,其中结肠吸收最好。5各组大鼠体肠吸收精密称取独活提取物I3g,独活提取物II0.15g(与提取物I中3种有效成分总含量基本相近),按“样品溶液的配制”方法,制得灌流液,进行结肠段灌流,按“大鼠在体肠吸收实验”方法进行考察。独活提取物I和II中3种成分吸收参数见表4。结果表明:独活提取物II中3种成分的Ka、Papp值显著小于独活提取物I中相应成分的Ka、Papp值(P<0.01)。重量分析法校正独活提取物I能直接溶解分散于灌流液,故提取物I灌流液直接用空白灌流液配制,但在配制提取物II的灌流液时,为了使样品溶解分散于空白灌流液,加入了少量乙醇和吐温80。在体单向灌流法进行肠吸收研究时,由于肠道能吸收或排泄水分,导致供试液体积改变,所以有必要对其进行校正。曾有文献报道,用不吸收的标记物如酚红或14C-PEG标示灌流液体积的变化,然而酚红本身能部分被吸收以及对某些化合物的肠道转运或分析测定有干扰,而14C-PEG存在放射性和安全性问题,故本文采