电针天枢穴对慢传输型便秘大鼠结肠平滑肌结构及cajl间质细胞的影响

电针天枢穴对慢传输型便秘大鼠结肠平滑肌结构及cajl间质细胞的影响

缓慢传播的便秘（stc）是一种缓慢存在的便秘，具有通过排便时间延长和肠道动力降低的特点。近年大量研究表明,针刺天枢等穴治疗STC取得了较满意疗效。但有关针刺取效作用机制研究的报道则很少。研究显示,胃肠壁内Cajal间质细胞(interstitialcellsofCajal,ICC)作为胃肠运动自主节律性的起搏细胞和兴奋传导细胞,具有产生电慢波、参与调节胃肠道平滑肌运动的功能,与许多胃肠运动障碍性疾病有关。本实验的研究目的在于通过观察电针“天枢”穴对STC大鼠结肠平滑肌结构及ICC的影响,探讨电针“天枢”穴治疗STC的作用机制,为临床治疗提供实验依据。1材料和方法1.1造模、分组、培养健康清洁级Wistar大鼠60只,雌雄各半,体质量100～120g,购自上海莱克斯实验动物有限公司[SCXK(沪)2007-0005]。随机选取40只进行STC造模,余20只为正常对照组。最后造模成功36只,将36只模型大鼠随机分为模型组、电针组,每组各18只。1.2试验试剂与仪器复方苯乙哌啶(常州康普药业有限公司),c-kit兔抗鼠多克隆抗体(美国SantaCruz公司),非生物素二步法检测试剂盒、3%过氧化氢溶液、DAB显色试剂盒、柠檬酸盐抗原修复液、磷酸盐缓冲液(PBS)等均购自北京中杉公司,0.3mm×15mm毫针(苏州华佗医疗器械厂),HANS-200A电针仪(南京济生医疗科技有限公司),RM2145组织切片机(美国Leica公司),BX4-60生物光学显微镜(日本Olympus),DP71型显微摄像系统(日本Olympus),JD801形态学图像分析系统(南京捷达公司)。1.3造模大鼠的饲料实验大鼠均分笼饲养于适宜的环境(16～25℃,相对湿度50%～70%,清洁安静)。适应性喂养5d后,40只造模大鼠饲喂含复方苯乙哌啶的饲料,给药剂量根据大鼠的体质量及饲料消耗量计算为每日8mg/kg,将药物混匀到饲料中让大鼠自食。每隔7d称量大鼠体质量1次,根据大鼠体质量变化适当调整给药剂量。正常组饲以普通干饲料(饲料由南京中医药大学SPF级实验动物中心配制)。饲养时间为120d,不限饮水。采用首粒黑便排出时间判定模型成功建立与否。1.4“天枢”穴的测定电针组动物于造模成功后电针双侧“天枢”穴。“天枢”穴定位采用拟人比照法,取大鼠胸腹正中线上,以剑突为一定位点,以耻骨联合上缘为另一定位点,两者连线的上2/3与下1/3的交点处旁开5mm为“天枢”穴。用特制鼠架将大鼠固定后,穴位周围剪去腹毛,皮肤常规消毒,用毫针针刺5mm深,接HANS-200A型电针仪,电流强度为0.8～1.3mA,采用疏密波,2Hz/15Hz,治疗15min。首粒黑便测定结束后,第2天开始治疗,每天治疗1次,连续治疗14d。正常组及模型组用同样鼠架固定,但不予其它处理。1.5免疫组化试剂制备模型建立测定:大鼠停药3d后,禁食,不禁水24h,采用活性炭悬液灌胃法测定首粒黑便排出时间。经口灌入50g/L活性炭悬液2mL(活性炭悬液的配制:准确称取阿拉伯树胶50g,加水400mL,煮沸至溶液透明,称取活性碳25g加至上述溶液中煮沸3次,待溶液凉后加水定容到500mL,使用前玻璃棒搅拌混匀)。从活性炭悬液灌胃完毕开始计时,记录从灌胃到首粒黑便排出的时间。结肠形态结构HE染色:治疗结束后,各组随机取大鼠6只,适应性喂养3d。颈椎脱臼处死,立即取距盲肠端2cm处结肠1cm左右,从肠系膜处剪开,生理盐水冲洗肠内容物,平铺后4%多聚甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋,每例标本连续切片2张,片厚5μm,裱于经多聚赖氨酸防脱片剂处理的载玻片上,置60℃烤箱中12h,备用。切片脱蜡至水,苏木精液染色7min;流水洗去苏木精染液2s;1%盐酸乙醇分化1～3s;流水冲洗30s;0.5%氨水返蓝;流水冲洗5min×3次;蒸馏水过洗1～2s;1%伊红染色1min;蒸馏水过洗1～2s;乙醇梯度脱水,各5min;二甲苯脱水5min×3次;中性树胶封片;显微镜观察,每组取6张切片,每张切片随机选5个高倍镜视野(10×40),应用DP71型图像获取系统采集图像,观察结肠壁形态结构,并用JD801形态学图像分析系统直线测量软件模块测量结肠平滑肌厚度。ICC免疫组化染色:按照即用型二步法(非生物素)检测免疫组化试剂盒说明书操作。石蜡切片制备如上;切片脱蜡至水;PBS浸泡5min;柠檬酸钠、高压修复抗原;自然冷却3～5min后,浸入冷水,冲洗10min,取出冷却至室温;PBS浸泡5min,取出;置3%双氧水中孵育10min,以灭活内源性过氧化酶;用PBS液冲洗2min×3次;滴加适当稀释的兔抗鼠多克隆c-kit抗体(按1∶150稀释),湿盒内37℃孵育90min;PBS冲洗2min×3次;滴加二抗,室温孵育30min;PBS冲洗2min×3次;DAB显色10min;蒸馏水或自来水冲洗;苏木素复染5min,然后控干;取出过水,盐酸乙醇稍浸一下;自来水冲洗3次;浸在自来水中10min;乙醇梯度脱水,各5min;二甲苯脱水5min×3次;中性树胶封片;显微镜观察,细胞质染色呈棕色为ICC阳性细胞。每组取6张切片,每张切片随机选5个高倍镜视野(10×40),应用DP71型图像获取系统采集图像,并用JD801形态学图像分析系统计算ICC免疫染色阳性细胞个数及平均吸光度值。1.6多组比较方法实验数据采用SPSS16.0软件进行分析。两组比较采用独立样本t检验;多组比较采用单因素方差分析,方差齐用LSD法检验,若方差不齐用Dunnett’sT3方法两两比较。数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1大鼠肠道传输情况造模过程中,大鼠死亡4只,解剖后均发现结肠、直肠中充满粪便,部分结肠扩张充气,平滑肌充血变薄,其中1只死亡前有呕吐现象,1只消瘦明显。经首粒黑便排出时间测定,造模组大鼠首粒黑便排出时间较正常组明显延长(P<0.05)。说明模型组与正常组相比,大鼠肠道传输速度明显减慢,表明造模成功。最后共36只造模成功,模型成功率为90%。见图1。2.2大鼠结肠形态结构图2显示,正常组大鼠结肠平滑肌细胞排列有序,肠黏膜腺体分布丰富。模型组大鼠平滑肌明显变薄,尤其是内环肌,最薄处只有3～4层肌细胞,并且见平滑肌细胞胞体萎缩,细胞之间出现分离,失去了紧密有序的正常排列;纵肌也有变薄,但不如环肌变化明显;肠黏膜的腺体萎缩,腺泡减少,分布稀疏。电针组大鼠结肠形态结构与正常组类似。3组大鼠结肠肌层厚度测量结果显示,模型组与正常组、电针组比较明显变薄(P<0.05),电针组与正常组结肠肌层厚度接近(P>0.05),提示电针组大鼠结肠平滑肌厚度较模型组有所改善,接近正常大鼠结肠的形态结构。2.3电针大鼠结肠小鼠理能力的变化显微镜下观察发现,正常组ICC的胞体和突起呈棕黄色,胞体较大,呈纺锤形、椭圆形或梭形,可见2个或2个以上的突起,相邻ICC形成带状或网络状结构,以肌间丛区域最丰富;模型组ICC形态及分布与正常组类似,但着色较淡、模糊,网络结构不连续;电针治疗后,电针组ICC形态、分布、细胞着色及网络结构的完整性均接近于正常组。模型组大鼠结肠平滑肌ICC免疫阳性细胞计数、平均吸光度值与正常组比较显著降低,电针组与模型组比较明显升高(均P<0.05);电针组大鼠结肠平滑肌ICC免疫阳性细胞计数、平均吸光度与正常组接近(P>0.05)。见图3。3电针组大鼠结肠第二、三应性及病理改变STC的发病因素多种多样,发病机制复杂,是近年研究的重点。研究显示,STC发病与肠神经系统、ICC细胞、平滑肌病变以及生活习惯、心理因素等众多因素相关。结肠平滑肌是胃肠道将化学能转换为机械能的最终执行者,它的形态异常和运动功能失调会直接影响到结肠的收缩与舒张。研究发现STC患者结肠平滑肌内有包涵体形成,而平滑肌细胞内大量包涵体的出现会导致平滑肌收缩性下降,进而减慢胃肠传输速度。Altomare等的研究证明,58%的严重STC患者结肠壁变薄,肌细胞空泡变性或脂肪变性,环肌萎缩,病变呈进行性过程,提示了STC患者有平滑肌肌病的存在。ICC是1893年由西班牙神经解剖学家Cajal于胃肠道神经系统中发现的一种与神经系统密切相关的非神经性间质细胞。ICC分布于食管中下段至乙状结肠的肠管壁各层及少数括约肌,胞体呈纺锤型或星状,核大而胞质少,有2～5个细长的突起,在胃肠道运动中为慢波电位的起搏细胞,并推进电活动传播,介导神经信号传递。Maeda等发现ICC细胞膜可特异性表达c-kit,是一种由c-kit基因编码的跨膜糖蛋白,属于酪氨酸激酶受体家族第三亚类。c-kit与其配体干细胞因子(SCF)结合所启动的信号通路对ICC的发育、分化及表型维持至关重要。目前研究证实,STC结肠伴有ICC数量、形态及功能的变化。Wedel等观察到,STC患者结肠ICC的数目显著减少,且ICC突起连接杂乱或不能相互连接形成网络。于彬等同样发现STC患者乙状结肠壁内ICC的数量均较正常对照组减少,且突起的分支亦减少,彼此间不能形成完整的细胞网络。电镜见ICC内溶酶体聚集、脂质沉积,突起间的缝隙连接较小、数量减少。本研究结果显示,模型组大鼠结肠肠壁形态结构存在明显的病理变化,提示STC患者排便困难与结肠平滑肌病理改变相关。而电针组平滑肌细胞形态趋于正常,平滑肌肌层厚度与正常组接近,说明电针“天枢”穴可能是通过改善结肠肠壁的这种病理改变而达到治疗目的