膜片钳技术在药物作用机制研究中的应用

膜片钳技术在药物作用机制研究中的应用

自1976年以来，德国生理学家neher和sakman领导的研究小组首次提出了一种称为膜片式酒精的新方法，该技术点燃了细胞和分子水平的生物化学研究的革命，并在现代细胞生物化学和细胞生物材料领域引发了新的技术革命。它与基因克隆技术并驾齐驱,给生命科学研究带来了巨大的前进动力。膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个)离子通道分子活动的技术。作为先进的细胞电生理技术,膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。自1981年经Hamill等及后人的进一步完善,其电流侧量灵敏度已达1pA,空间分辨率达到1μm和时间分辨率达到10μs,并且已发展出许多适合不同需要的记录模式。膜片钳技术为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。该技术的兴起与应用,使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解,而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新,同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。本文拟对膜片钳技术在胃肠道、心血管、神经科学以及药理学研究中的应用作一综述。1玻璃微电极吸附剂吸附法检测离子通道电流膜片钳技术是一种以记录离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术。该技术可将一尖端经加热抛光的玻璃微电极吸管吸附一片只有几平方微米的细胞膜,形成吸管内外近似电密封。吸管尖端和细胞表面经过清洁处理,再在吸管内施以负压,使微电极尖端与记录的细胞膜片表面形成GΩ级封接,电阻值为10~100GΩ,此时,玻璃微电极和细胞膜间的距离小于1nm,使得吸附的膜片与其周围在电学上隔离,在次基础上固定电位,对次膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行检测记录的方法。原理(见图1)。2tpatch联合全细胞技术包括两大类四种:第一大类单通道记录(single-channelrecording)包括三种:(1)细胞吸附式(cell-attachedpatch)将两次拉制后,经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面,形成高阻封接,在细胞膜表面隔离出一小片膜,即通过微管电极对膜片进行电压钳制,从而测量膜电流。(2)内面向外模式(inside-outpatch)高阻封接形成后,将微管电极轻轻提起,使其与细胞分离,电极端形成密封小泡,在空气中短暂暴露几秒钟后,小泡破裂再回到溶液中,使小泡的外半部分破裂即得。(3)外面向外模式(outside-outpatch)高阻封接形成后,继续以负压抽吸,膜片破裂,再将玻管慢慢从细胞表面提起,,断端游离部分自行融合成脂质双层而得到。第二大类即全细胞模式(whole-cellmode)在细胞吸附式的基础上,继续以负压抽吸,使电极管内细胞膜破裂,电极内液与胞内液直接相通而得到,此方式既可记录膜电位又可记录膜电流。全细胞记录反映的是整个细胞膜上所有离子通道电活动的总和。全细胞记录的优点在于,能保持细胞及其反应性的完整性。这样可以在细胞水平上观察受药物的作用后神经元电活动的总体反应特点。当应用特异的阻断剂,还可凸显某一类离子通道的特点。不足之处是由于电极与细胞间交换快,细胞内环境很容易破坏,因此记录所用的电极液应与胞浆主要成分相同,如高K+,低Na+和Ca2+及一定的缓冲成分和能量代谢所需的物质。另外,近年来由全细胞模式派生的穿孔式膜片的全细胞记录法也是克服以上缺点的有效方法。记录中应注意解决好膜电容干扰及通路电阻的补偿两个造成误差的环节。3单通道类型膜片钳技术对细胞膜通道电流的记录具有很高的分辨率,信息含量大;能够改变细胞膜电位,进行单细胞记录,同时可以控制改变细胞的内外溶液成分,灵活性好;应用范围广:可以分析检测所有的离子通道类型;能记录到pA级电流变化和单通道开关状态,因此具有很高的高灵敏性;相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权威性和精确性。但是受限于膜片钳技术自身的缺点,仍然存在一些不可避免的问题,如每次只能对单个细胞进行操作,通量低,难以对细胞网络以及细胞间的通信进行研究,不能对胞内液进行方便换取。在测量过程中,由于通道表达的缺乏会造成数据点丢失而引起数据不一致,需进行大量的实验。对操作者的要求也非常高,需要熟练的技术人员进行小心翼翼、耗时耗力地在显微镜下手动控制显微操作仪,完成吸附、加液、换药、测量等一系列工作。4膜片限制技术的应用4.1在胃研究中的应用4.1.1ca2+内流活化钙离子平滑肌收缩主要与L型Ca2+通道及K+通道的活性有关。能引起胃肠道平滑肌收缩的胃肠道电位变化是慢波和动作电位。慢波上升相来源于Ca2+内流,部分复极相来源于电压依赖性钾电流(延迟整流性钾电流),二者平衡时形成平台相,Ca2+内流活化钙离子依赖的钾离子(KCa)通道的外向电流导致的完全复极化。动作电位发生机制:当细胞膜电位由于基本电节律波动或前电位变化,达到电压依赖性L型Ca2+通道的阈值后(约-40mv),Ca2+通道开放产生强的内向电流,通过其自身的正反馈作用可产生峰电位的快速上升相,达到0mv附近,由于Ca2+大量内流使细胞内Ca2+浓度显著升高,活化了大量的KCa通道,产生强有力的外向电流,导致快速和完全的复极化。4.1.2信号通道:主要分为5个通道和5个自由通道胃肠道平滑肌的离子通道按其兴奋方式分为三种类型:①电压门控通道:电压门控的钠通道、钾通道、钙通道等;②配体门控通道:乙酰胆碱受体通道、毒蕈碱受体通道、谷氨酸受体通道等;③机械门控通道:牵张敏感通道和容积敏感通道等。依照对离子通透性的不同又可分为以下几种类型:钾通道、钙通道、氯通道、钠通道和非选择性阳离子通道等。4.1.3黄连素和总黄体酮对大鼠结肠两极化的影响钾通道通过维持静息膜电位,影响基本电节律以及动作电位来控制胃肠平滑肌的收缩活动。电压依赖性钾通道在正常的细胞膜电位时可产生外向电流,对于调控结肠平滑肌细胞电活动有特别重要的意义。大鼠近端结肠平滑肌细胞可记录到快速激活型钾电流和延迟整流型钾电流,李世英等等通过研究大黄素对大鼠近端结肠平滑肌细胞电压依赖性钾通道的作用,探讨大黄素促胃肠动力的机制,其研究表明大黄素可浓度依赖性地阻断延迟整流型钾通道及抑制快速激活型钾电流。此种作用可能是其增强结肠平滑肌细胞电兴奋性和收缩活动的机制之一。黄连素是一种钾通道阻断剂,能显著抑制豚鼠结肠平滑肌细胞膜IK(Ca)和K(V),并呈现浓度依赖性。钾通道开放受抑制就能抑制平滑肌细胞膜复极化,,延长其不应期,导致平滑肌收缩频率下降,黄连素抑制IK(Ca)能间接证实黄连素能抑制结肠平滑肌细胞内钙离子浓度的升高,从而影响结肠平滑肌的兴奋收缩耦联,抑制平滑肌收缩。李世英等研究表明成年豚鼠结肠平滑肌的内向电流主要通过高电压依赖型钙通道(L型),并利用全细胞膜片钳技术研究染料木黄酮可对豚鼠近端结肠电压依赖性钙通道的影响及其作用途径,其研究表明染料木黄酮可通过酪氨酸途径阻断豚鼠近端结肠平滑肌细胞的L钙通道的电流抑制结肠平滑肌的运动。徐龙等的细胞膜片钳结果显示黄体酮可显著抑制结肠平滑肌细胞的钙离子通道的电流。细胞外灌流液内添加则黄体酮不能抑制BKCa,提示黄体酮是通过抑制细胞外钙离子的内流,进而抑制BKCa。其作用机制与减少细胞外钙内流及抑制BKCa有关,这种作用可部分解释临床上IBS妇女患病更普遍的现象,对女性IBS患者的激素治疗有一定的提示作用。4.2对心肌细胞ca2+通道和n人类心脏主要存在Na+通道、Ca2+通道、K+通道等主要的离子通道。心脏的自发节律性是受心肌细胞的电活动控制的,而心肌电活动的基础便是心肌细胞的各种离子电流的变化。因此,膜片钳技术可以用来分析心肌静息电位及其自发去极化的机制,对钠、钾、钙和乙酰胆碱通道的调控机制进行更深入的了解。此外,膜片钳技术也可以用来分析心脏在病理状态下引起通道活性和受体功能改变的机理,从而可以从根本上对各种心脏病进行诊断和治疗。已有研究证实,Na+通道基因突变,Na+通道失活关闭不正常,Na+离子内流增加,动作电位时程异常延长,可能诱发严重的室性心律失常,是该病心脏猝死的主要原因。心肌细胞上至少有4种Ca2+通道,2种在细胞膜上,分别为L型和T型,另外2种是肌浆网膜上的Ca2+释放通道,主要为心肌细胞兴奋收缩耦联中调节心肌收缩力的一个关键环节,还可以形成自律细胞的起搏电流。K+通道的种类很多,有延迟整流K+通道、IKI通道、Ito通道、KATP通道、KAch通道以及Na+-K+泵等。成都中医药大学苗维纳等采用内面向外膜片钳单通道记录技术研究表明,葛根素对分离的豚鼠单个心室肌细胞的K+、L型Ca2+通道及Na+均有阻滞作用。王赫等应用全细胞膜片钳技术记录冬虫夏草水提物对豚鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(IK1)、延迟整流钾电流(IK)及大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的影响,结果显示冬虫夏草抗心律失常作用与它对心肌细胞钾通道的作用有关。它增加IK、Ito的同时抑制IK1,将会使动作电位时程缩短而不至于发生早后除极和迟后除极。此外,还有大量有关心肌细胞钙通道的研究,涉及药物包括三七总皂甙、莲心碱、人参等。4.3膜片钳技术下动脉配方的激活血管平滑肌主要功能是调节血压,其收缩-舒张受多种离子的调节,其中最主要的是钙离子的影响。现已证实血管平滑肌上存在电压依赖的钠通道、多种钙和钾通道。这些通道的开关将直接或间接影响血管平滑肌的生理功能。在血管平滑肌上分布密度较高的主要是钙通道和钙激活钾通道。L型钙通道是血管平滑肌细胞上的主要钙通道,经L型钙通道进入细胞内的钙离子是提高胞质钙离子浓度的主要途径,也是触发血管平滑肌细胞收缩的基础。当在某些病理状态下钙离子通道发生改变,可以引起细胞内钙离子浓度升高,其病理变化多见于高血压和动脉粥样硬化。研究发现血管平滑肌细胞的凋亡与K+通道活动增加有关,在动脉粥样硬化发生与发展过程中大电导型钙激活钾通道起着重要的功能作用。某些药物影响动脉粥样硬化血管平滑肌细胞离子通道而发挥作用。膜片钳技术给动脉粥样硬化发病机理研究带来了新的亮点。Wiecha等应用膜片钳技术对冠状As斑块平滑肌细胞(SMCP)与正常冠状动脉平滑肌细胞(SMCM)BKCa的特性进行了比较研究。结果表明冠状As斑块平滑肌细胞BKCa比正常冠状动脉平滑肌细胞BKCa有较高的通道活性。这一发现意味着BKCa通道在动脉粥样硬化的发生与发展中起着重要的功能作用。Crews等报道外源性添加黄体酮可抑制高钾引起动脉平滑肌肌条的收缩,而高钾可引起平滑肌细胞膜去极化促进细胞外Ca2+内流而引起平滑肌收缩,因此推断黄体酮可通过抑制细胞外钙离子内流,从而抑制血管平滑肌的收缩。因此,使用膜片钳技术可以对平滑肌膜电位进行监控和分析,得到其活动的详细机制。4.4决定型全细胞膜片钳市场应用膜片钳技术可以研究神经信号的产生和传导。由于中枢神经系统的脆弱性和难以接近性,研究脑的网络特性及其复杂的调控功能是十分困难的。在具有简单网络系统的离体脑片上应用膜片钳技术,为这一方面的深入研究开辟了一个崭新的领域。目前将膜片钳技术应用到神经系统的研究是不少的,但主要侧重于用膜片钳技术观察不同部位细胞形态学和电生理特性的研究;各种化学药物的作用对神经系统影响的研究;适于膜片钳技术研究的细胞的制备及分离方法。例如徐龙河等人的罗哌卡因和布比卡因对大鼠背根神经节钠通道阻滞作用的比较,结论是罗哌卡因优先阻滞TTX-R钠通道,对TTX-R钠通道和TTX-S钠通道的选择性阻滞是其硬膜外麻醉时感觉运动分离的原因之一;又如朱淑娟等人的急性分离Meynert核团神经元方法及其应用,本方法可以获取活的Meynert核团单个神经元,用于单细胞膜片钳、激光共聚焦、流式细胞术等研究。这些研究给人们的研究带来好的一面,使神经系统的研究有了更好的发展。刘向明等在初级感觉传入神经元一小鼠三叉根神经节(Trigeminalrootganglia,TRG)和大鼠背根神经节(Dorsalrootganglion,DRG)细胞上观察血竭对其细胞膜上电压门控性钠通道电流(INa+)的影响,因为钠电流为初级感觉神经元产生动作电位并借以传递痛觉信息的主要离子电流。结果发现云南血竭均显著抑制了TRG,DRG细胞电压门控性钠通道电流,并呈浓度依赖性。既然血竭可以不同程度的抑制初级感觉神经元细胞膜上电压门控性钠通道电流,提示血竭在颜面部及躯体的镇痛作用中除了与其抗菌消炎有关外,尚可能与其直接干预了初级感觉神经元TRG细胞和DRG细胞的痛觉信息中枢传入有关。嗅觉障碍不单纯是嗅觉系统病变的表现,许多情况下,其他神经系统的病变亦可表现一定的嗅觉障碍,具体机制尚不清楚。因此对嗅感觉神经细胞电生理学和药理学特性的研究,是研究嗅觉系统病变和其它神经系统病变的基础。作为嗅觉传导途径的初级神经元,嗅感觉神经细胞具有接受外周嗅觉冲动并将嗅觉信号向中枢传导的作用。利用全细胞膜片钳技术对其离子通道进行记录和分析,可以了解该细胞膜上离子通道的活性及离子通道阻滞剂和药物对通道活动的影响。倪茂美等用全细胞电压钳技术对嗅感觉神经细胞胞膜上的离子通道进行了记录和研究,初步了解到急性酶分离的小鼠嗅感觉神经细胞胞膜上存在有对TTX敏感的钠通道及包含有瞬时成分和持续成分并能被CsCl完全阻断的钾通道,为今后进一步研究嗅觉传导机制提供了参考4.5离子通道为靶标药物的应用细胞是通过细胞膜与外界隔离的,在细胞膜上有很多种离子通道,细胞通过这些通道与外界进行离子交换。离子通道在许多细胞活动中都起关键作用,它是生物电活动的基础,在细胞内和细胞间信号传递中起着重要作用。随着基因组测序工作的完成,更多的离子通道基因被鉴定出来,离子通道基因约占1.5%,至少有400个基因编码离子通道。相应的由于离子通道功能改变所引起的中枢及外周疾病也越来越受到重视。以离子通道作为靶标的药物现占总靶标的5%,而潜在的离子通道靶标药物将占总靶标的25%,因此开发离子通道为靶标的药物将具有广阔的市场前景。已知与离子通道有关的疾病主要有:癫痫(epilepsy)、心律失常(Cardiacarrhythmia)、糖尿病(diabetes)、高血压(hypertension)、舞蹈症(Huntingtons'disease)、帕金森症(Parkinsons’disease)……。药物研制的关键在于探测药物作用的靶点。在药物筛选中,将目的药剂以吹打或灌注方式直接施加于培养细胞,借助特定离子通道阻断剂,利用膜片钳方可迅速判明药物作用及作用方式等问题。因此,膜片钳对于药品的研制、于生产也有着十分巨大的促进作用。制药企业还可以利用当前新兴药物虚拟筛选技术进行初筛,把初筛结果再结合全自动膜片钳技术进行