葡聚糖硫酸钠诱导uc急性模型浓度及时间的研究

葡聚糖硫酸钠诱导uc急性模型浓度及时间的研究

近年来，尽管mc的基础和临床研究取得了很大进展，但要进一步深入理解mc的病理生理机制，开发和治疗mc的药物是非常重要的。理想的动物UC模型应力求其病因、病理生理、组织形态及临床表现近似于人类UC。现在国内外应用最多的是葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodium,简称DSS)诱导UC模型,本研究重点探索建立此模型所需要的DSS浓度和暴露时间。材料和方法一、材料表面1.动物饲养及分组健康C57BL/6小鼠50只,雄性,体重18～22g,购于上海斯莱克实验动物中心(许可证号为SCXK2003_0003),所有动物购回后在福建医科大学动物房饲养2周,用混合配方饲料(由上海斯莱克实验动物中心提供)喂养,自由进食饮水,每日更换饮水、饮料,保持小鼠生活环境通风及清洁卫生。观察进食、饮水、活动、大小便情况,确认小鼠健康及适应环境后,开始按照体重随机分为4组:①正常组(n=8);②3%DSS组(n=14);③5%DSS组(n=14);④8%DSS组(n=14),各组体重统计学比较无显著差异(P>0.05)。2.oxydmw葡聚糖硫酸钠dextransulfatesodium,简称DSS(MW=36,000～44,000,硫磺含量为18%～20%,MPBiomedicalslnc.CA,USA)。二、方法1.急性uc模型的建立根据方法建立结肠炎模型:将DSS溶入蒸馏水,配制成3%、5%、8%(W/V)的DSS溶液,让C57BL/6小鼠自由饮用6天,建立急性UC模型,正常组饮用蒸馏水作为对照。2.小鼠肠腔炎观小鼠自由饮用DSS溶液6天后,用颈椎脱臼的方法处死小鼠,迅速剖取结肠,沿肠系膜剪开,生理盐水漂洗,开水烫过的毛笔刷去肠腔内容物,并将结肠平铺于超薄泡沫上,大头针固定后,肉眼观察炎症及溃疡情况。距肛门及回盲部1.0cm处各取结肠组织0.5cm,以10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,连续4μm病理切片(HE染色),显微镜下观察了解结肠黏膜损伤情况。3.病理组织学检测(1)疾病活动指数(DAI)的评估:每日观察小鼠的体重、大便性状和隐血情况,按Table1进行评分。将体重下降、大便性状和隐血情况的评分相加,得出每只小鼠的DAI,以评估疾病活动情况。(2)组织学损伤指数(HI)的评估:颈椎脱臼法处死小鼠后,剖腹,取肛门至回盲部的结肠,沿肠系膜缘纵行剖开,肉眼发现结肠肠腔里有鲜血,偶见小糜烂,但是无明显的溃疡。每只动物在距肛门及回盲部0.5cm处取1块组织标本,常规石蜡包埋、切片(4μm)、HE染色,观察组织学改变并按Table2评分,HI用黏膜损伤程度及范围记分的和来表示。(3)病理切片(HE染色)观察。三、统计学分析数据均用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,采用SPSS10.0软件进行统计学分析,各组间的差异比较用t检验(方差齐)或者t’检验(方差不齐),设α=0.05,P<0.05为差异有显著性。小鼠结肠正常且病理组织学检测1.一般状况:饮DSS水后第1天,各组体重增长,饮水和进食较多,3%组有9只小鼠大便出现异常,5%组和8%组所有小鼠大便出现异常;饮用DSS第3天,各组小鼠体重出现下降,饮水和进食明显减少;饮用DSS第5天,小鼠体重下降很明显,出现懒动,精神萎靡,体温下降;饮用DSS的6天,小鼠出现死亡。实验期间,正常组小鼠大小便正常、体重增加、毛发有光泽、饮食、活动、精神状态均正常。2.实验组小鼠大便性状变化(表3)。3.DSS摄取量与结肠炎的临床参数之间的联系及组间DAI比较结果(表4a、表4b)。4.各模型组的病理评分(HI)及组间比较结果(表5a、表5b)。5.病理切片(HE染色)观察(附图)。正常组:小鼠结肠黏膜完整,黏膜上皮完整、连续,腺体排列规则、结构清楚,无炎症细胞浸润及溃疡。模型组:结肠黏膜不完整,可见多灶性浅溃疡;大部分腺体被破坏,部分病灶表面上仅少许残留或完全被破坏,腺体正常结构丧失,排列紊乱,腺腔消失;有炎症细胞浸润,以中性粒细胞为主,伴有少量的淋巴、单核细胞,炎症主要累及黏膜和黏膜下层,少数可达浆膜层;黏膜下层水肿,可见到淋巴细胞聚集形成淋巴滤泡;在一些病变较轻的部位,可见到部分腺体完整和溃疡并存。大多数动物远端结肠的损伤比近端结肠严重,某些动物近端结肠损伤更严重。dss模型的临床应用目前常用的UC模型有一下几种:1.醋酸模型:该法是用浓度为4%～8%的乙酸0.5ml灌肠,作用10～20s后注入5ml的生理盐水冲洗3次。致炎机理是是应用化学刺激造成大鼠结肠黏膜及血管的直接损伤作用,导致炎症,犹如UC的急性期表现。醋酸模型类似人类肠道急性炎症发作期,尤为适用于观察中药疗效及评价黏膜愈合机制,但其早期黏膜损伤的非特异性、缺乏慢性期以及易受个体差异(肠道的耐受性不同)的影响为其缺点。2.角叉菜胶模型:该法是用角叉菜胶水溶液饲饮豚鼠、兔、鼠等制出实验性UC模型。机理是角叉菜胶能够损伤结肠上皮细胞间的紧密连接,导致黏膜通透性增加。其优点是持续时间长,急性期3～6周,持续6～8周,停止饮用角叉菜胶后炎症持续1～2周,适合于防治药物的筛选和研究。缺点是缺少自发、复发的特点,且病变部位多集中于盲肠,许多实验用豚鼠,造价高,不适合于人类免疫学和基因学方面的研究。3.CD4+T细胞移植、基因敲除和HLA_B27转基因动物模型:此模型可从基因水平上阐明肠道炎症的发生,从而直观地反应免疫系统的病因,它表现的炎症为慢性、持续性,因而可用来长期监测与研究。可是重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠和转基因小鼠来源困难,价格昂贵,饲养条件高,实验技术难度大,要求条件高,暂难推广。4.三硝基苯磺酸(TNBS)模型:采用将30mgTNBS溶入50%的0.25ml乙醇给SD大鼠灌肠可制造出克隆病模型。其主要致炎机理是乙醇破坏肠粘膜屏障,TNBS渗入结肠组织与大分子物质结合,形成全抗原,引起肠壁一系列免疫应答和炎症反应。此模型的优点是方法简单,致炎效果好,重复性好,有类似人类克隆病的大体病理及组织学改变,缺点是致炎病程长,个体差异大,是目前常用的克隆病模型之一。DSS模型既可作为研究人类UC的致炎机理及抗炎药物模型,也可以作为免疫机理及遗传学研究的模型。从以上实验结果也可以看出,一方面其症状、体征等一般情况完全符合UC的临床表现;另一方面,此模型小鼠体重变化、大便性状的改变及疾病活动评分情况,特别是其病理切片的典型病理特征与人类UC变化一致。这些都说明该发复制的动物模型是成功的、理想的。DSS是由蔗糖合成的一种硫酸多糖体,具有和肝素同样的抗止血及抗凝血作用。DSS诱发结肠炎的具体机制仍不清楚,可能与巨噬细胞功能失调、肠道菌群失调及DSS对结肠上皮的毒性作用有关,也可能与DSS上调TNF_α,IFN_γ,IL_10的表达及与嗜酸性粒细胞脱颗粒有关。多项研究证实,DSS_UC模型的成功受以下几种因素的影响:如①动物的种系;②DSS的浓度;③DSS的分子量;④DSS的暴露时间。其中DSS浓度是本实验成功的最关键因素,它影响着造模时间及临床表现。在本实验中,通过多方检索,考虑到DSS分子量大小会影响病变部位及小鼠不同种系对DSS的敏感性差异,我们采用分子量为Mr36000～44000的DSS及C57BJ/6小鼠造模,其主要目的是摸索造模浓度及时间。结果显示,DAI评分随着浓度呈线性增加,呈浓度依赖性远端结肠HI评分和近端结肠评分无浓度依赖性,远端结肠病变更严重。DSS诱导的肠粘膜急性损伤,其程度轻重呈浓度依赖性曾经在Balb/c小鼠上得到证实。此实验中,急性肠黏膜损伤程度轻重与浓度无明显相关可能与小鼠的品系不同有关,提示了UC的发病受遗传因素的影响。Grangeretal经研究给出了DSS摄取量的计算公式DSS(mg/g)=总饮水量(ml)×[DSS(mg)/100ml]/小鼠的初始体重(g),指出诱导可靠和重复性好的UC模型(以组织MPO的活性和组织病理变化为标准),DSS总摄取量的最低阈值是30mg/g体重,只要DSS的负荷量达到30mg/g体重这个关键剂量,DSS总摄入量的差异不会影响炎症反应的严重程度。本研究中实验组小鼠DSS平均摄取量分别为:3%组40.93mg/g体重,5%组60.17mg/g体重、8%组89.42mg/g体重。各组DSS平均摄取量>30mg/g体重,其病理表现无显著性差异,进一步证实了此结论。在本实验中,饮用DSS第5天,各浓度的临床表现已经无明显差异,但是第6天,各浓度的死亡率相差太大,各组死亡率分别为:3%组为7.1%,5%组为28.6%,8%组为57.1%。解剖肠腔,发现回盲部和结肠,甚至空肠、回肠充满血便,推测可能是严重的脱水及肝脏凝血机制损害致结肠局部病变失血过多而致死亡。其可能的死因已经被证实过。未来的研究应检测电解质、肝功能及肾功能