当归补血汤含药血清对氧化修饰低密度脂蛋白趋化单核细胞作用的影响

当归补血汤含药血清对氧化修饰低密度脂蛋白趋化单核细胞作用的影响

在动脉膜下，低密度脂肪通过氧化反应形成低密度甘油（oxlcd）。OxLDLs对单核细胞(monocytes,MC)有趋化活性,使MC向血管内皮下聚集,导致泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)形成的早期关键病理变化机制。当归补血汤具有抗自由基损伤和调节脂质代谢紊乱的作用,可以减轻动脉粥样硬化。为探讨当归补血汤抗动脉粥样硬化的作用机理,本研究观察了OxLDLs对兔单核细胞的趋化性及当归补血汤对其的影响。材料和方法1.1实验动物1.2药物和试剂1.3兔模型的构建1.4mc的分离和识别1.5当归补血汤的制备1.6ldl被氧化修饰兔血LDL(p=1.040～1.063kg/L)采用1次性密度超速离心法制备,按Lowrys法测定LDL含量。取As模型新西兰兔新鲜血,不抗凝,室温低速离心分离血清,用溴化钾调浓度至1.30kg/L,4℃50000r/min离心5h收集LDL,4℃于磷酸盐缓冲液(PBS)中透析48h,超滤除菌后4℃保存。在LDL(1kg/L)中加入终浓度为5μmol/L的CuS04溶液使其被氧化修饰,37℃温育24h,用PBS透析24h,超滤除菌后4℃保存。测硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituricacid-reactivesubstance,TBARS)值以判断LDL是否被氧化。用Cu2+氧化后OxLDLs的TBARS值为63.0～78.5mol/mg,未被氧化的LDL的TBARS值为1.2～3.2nmol/mg。1.7彰化实验1.8统计分析2含药血清对oxldls的趋化作用当归补血汤含药血清对单核细胞的趋化作用,结果见表1、图1、图2。表1结果显示:自由趋化组由于趋化小室下室未加OxLDLs,MC的趋化数很小,而OxLDLs组与自由趋化组比较差异有显著意义,表明OxLDLs对MC有很强的趋化作用;当归补血汤组MC的数目比OxLDLs组减少(P<0.01),说明当归补血汤含药血清对OxLDLs引起的MC趋化性具有抑制作用,但仍未达到正常水平(与自由趋化组比,P<0.05);黄芪组和当归组中OxLDLs趋化的MC数目与模型组比较无明显改变(P>0.05)。灭活含药血清与不灭活含药血清对MC的趋化作用基本相同,说明含药血清是否灭活对本实验无影响。图1、图2结果显示各组上室滤膜上MC数目相仿,但MC趋化通过滤膜到达下室滤膜的数目则差异较大,OxLDLs组MC数目比自由趋化组明显增多,而当归补血汤组比OxLDLs组MC数目明显减少。3蛋白质模型的制备血浆脂质和脂蛋白沉积于动脉内膜下,单核细胞粘附于血管内皮细胞并迁入内皮,摄取脂质转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)形成的早期关键病理变化。在动脉内膜下,低密度脂蛋白经过氧化修饰形成氧化修饰低密度脂蛋白(OxLDLs)。OxLDLs能促进单核细胞向血管内皮下聚集,导致泡沫细胞的形成,如果能阻断OxLDLs诱导单核细胞聚集,则可在As病变的早期发展阶段阻断其进程,但目前尚未见研究报道。本实验结果表明,当归补血汤含药血清能抑制OxLDLs对MC的趋化作用,而单味当归、单味黄芪抑制作用较弱,提示当归补血汤具有阻断OxLDLs诱导单核细胞聚集的作用,为该方药理机制的进一步研究和有效成份的提取提供了线索。另一方面,当归补血汤复方抑制MC的趋化的作用比当归补血汤中单味当归、单味黄芪的作用强,说明了中药复方中各药之间协同作用的重要性。新西兰兔6只普通级雌雄各半,体质量平均为2kg,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:粤检证字2003A001号。按《内外伤辨惑论》中当归补血汤原方的配伍比例(黄芪一两,当归二钱)即黄芪和当归的质量比为5:1称取生药。当归和黄芪均使用道地药材,当归用甘肃产品,黄芪用内蒙古产品,购自广东省药材公司并加以鉴定。实际灌胃剂量按动物体表面积换算量的10倍计,将方药用清水煎煮并浓缩成112k/L药液单味当归煎煮并浓缩成1.88kg/L药液,单味黄芪煎煮并浓缩成9.32kg/L药液;Lowrys法蛋白质定量测定试剂盒,购自申能博彩生物科技有限公司;Transwell双层细胞培养板为美国Costar公司产品,共24孔,每孔分上下两室,上室较小,可置于相对较大的下室中,上下室底面均置有孔径0.4μm的滤膜;紫外可见光分光光度计:Ultrospect3300;倒置显微镜:ZEISSAXIOVERT200。每兔每日喂以含1g胆固醇的饲料,同时1次性静脉注射牛血清白蛋白(250mg/kg),使动脉发生免疫损伤,5周后形成类似于人As的病变。取As模型新西兰兔血,20g/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝,用淋巴细胞分离液(percoll)离心,分离兔血单核细胞(MC),利用经明胶和自身血浆处理的塑料平皿收集附壁的MC;加入DMEM培养基培养,制成细胞悬液,细胞密度为2×108个/L,用非特异酯酶染色检查,MC纯度大于95%,台盼蓝拒染试验证明活细胞大于96%以上。6只兔随机分为3组,每组2只,分别给予当归补血汤、单味当归和单味黄芪药液,每只均6mL/d,分2次灌胃,连续给药3d,第3天灌胃后禁食,次晨灌药1次,灌药后1h在无菌条件下心脏采血,分离血清。不灭活组药物血清以0.45μm及0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌后,-40℃保存备用;灭活组药物血清以56℃、30min灭活后,再以0.45μm及0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌后,-40℃保存备用。采用Tranwell双层细胞培养板检测OxLDLs对MC的趋化性,通过观察上室内MC通过滤膜到达下室滤膜数目的多少判定含药血清对趋化性的影响。实验分组:①自由趋化组(正常组):上室加入用DMEM培养基制成的MC悬液,下室加满与上室相同的培养基;②OxLDLs组(模型组):上室加入用DMEM培养基制成的MC悬液,下室加入含1.0mmol/LOxLDLs的DMEM培养基;③黄芪组:上室加入MC悬液和含黄芪中药血清,下室加入含1.0mmol/LOxLDLs的DMEM培养基;④当归组:上室加入MC悬液和含当归中药血清,下室加入含1.0mmol/LOxLDLs的DMEM培养基;⑤当归补血汤组:上室加入MC悬液和含黄芪当归中药血清,下室加入含1.0mmol/LOxLDLs的DMEM培养基。将Tranwell双层培养板置于37℃,体积分数为5%的C02培养箱中温育5h。用手术刀切取上、下两室底面的滤膜,将无光泽面向下浸入生理盐水中,轻轻漂洗;将滤膜光泽面朝上,贴在