免疫学检测法汇总

免疫学检测法免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于有关免疫疾病的诊疗、疗效评价及发病机制的研究。如对传染病、免疫增殖性疾病、免疫缺损病、超敏反映、本身免疫病、移植排斥反映肿瘤的免疫学检测，对诊疗、治疗都有很大协助。另外在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查不仅推动了对多个免疫学现象的研究，并且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。本章仅介绍惯用免疫学检测办法的原理，简要过程和实用意义。第一节抗原或抗体的检测一、检测的原理借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的多个现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。1．抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合同样不是化学的反映，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。另外，反映温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表达。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。2．抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简朴，即用已知的抗体和待检样品混合，通过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就阐明待检样品中有对应的抗原存在。若无预期的现象发生，则阐明样品中无对应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中与否有对应抗体。对抗原或抗体进行定量检测时，以反映中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。（1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量：在一定的反映条件下，加入的已知抗体（或抗原）的浓度一定，反映产生的免疫复合物多少与待检样品中含有对应抗原（或抗体）量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性原则曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。如免疫单向扩散实验、免疫比浊实验和酶联免疫检测等都属于类办法。（2）抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反映抗原抗体反映强弱时，就不能以检测反映强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，把浓度低的反映成分（抗原或抗体）的浓度固定，把浓度高的另反映成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的对应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度（如甲兔的抗体效价为1/，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高）。也就是表达效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清（抗原）和抗体（免疫兔血清）相比，浓度高，故应稀释抗原。二、抗原或抗体检测的实用意义1．抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功效的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及多个本身抗体，对有关疾病的诊疗有重要意义。2．抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可下列四类：（1）多个微生物及其大分子产物：用于传染病诊疗、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。（2）生物体内多个大分子物质：涉及多个血清蛋白（如各类免疫球蛋白、补体的多个成分）、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及多个疾病的诊疗有重要意义。（3）人和动物细胞的表面分子：涉及细胞表面多个分化抗原（如CD抗原）、同种异型抗原（血型抗原或MHC抗原）、病毒有关抗原和肿瘤有关性情抗原等。检测这些抗原对多个细胞的分类、分化过程及功效研究、对多个与免疫有关的疾病的诊疗及发病机制的研究，都有重要意义。（4）多个半抗原物质：某些药品、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，能够分别将它们偶联到大分子的载体上，构成人工结合的完全抗原。用其免疫动物，制备出多个半抗原的抗体，应用于多个半抗原物质的检测，例如对某些病人在服用药品后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的办法。三、抗原或抗体检测的办法由于多个检测办法中所用的抗原性状不同，出现成果的现象也不同。最广泛应用办法有下述几个：（一）沉淀反映可溶性抗原与抗体结合，在两者比例适宜时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反映体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反映称为沉淀反映（precipitationneaction）。1．环状沉淀实验先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径不大于0.5cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀实验（ringprecipitationtest）,此法简便易行，需用材料较多是其缺点。2．单向免疫扩散实验单向免疫扩散实验（singleimmunodiffusion）是在凝胶中进行的沉淀反映。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适宜位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正有关。本办法简便，易于观察成果，可测定抗原的敏捷度（最低浓度）约为10～20μg/ml，惯用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需1～2天才干当作果（图20-1）图20-1单向免疫扩散实验示意图3．免疫比浊法当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成某些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也对应加强。免疫比浊法（immunonephelomytry）就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，通过一段时间，用光散射浊度计（nephelometry）测量反映液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。4，双向免疫扩散实验双免疫扩散实验（doubleimmunodiffusion）是在琼脂板上按一定距离打数小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法惯用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原有关性分析（图20-2）。图20-2双向免疫扩散实验示意图5．对流免疫电泳对流电泳（counterimmunoelectrophoresis）是一敏感快速的检测办法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察成果。6．免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)的办法分成两个环节，即先进行电泳，再进行琼脂扩散。先将样品加入琼脂中电泳，将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。然后在适宜的位置上沿电泳方向挖始终线形槽，于槽内加入含有针对多个抗原混合抗体液，让各抗原成分与对应抗体进行双向免疫扩散，可形成多答卷沉淀线。惯用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊疗或鉴别诊疗有重要意义（图20-3）。

图20-3免疫电泳法基本步示决图7．免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting）又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。第一步，为电泳分离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。第二步，将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上（电印迹），然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。如果病人血清中含有与一种或几个抗原相对应的抗体的话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体能够和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反映，最后加入显色底物（如果抗人Ig是用酶标记的）或做放射自显影（抗人Ig用125Ⅰ标记）以显示成果（图20-4）。

图20-4用免疫印迹法检查血清中的HIV病毒抗体第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离；第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上；第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上；第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上；第五步：加入显色底物（或放射自显影）显现第二抗体（二）凝集反映细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与对应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反映（agglutination）。1．直接凝集直接凝集（directagglutination）是将细菌或红细胞与对应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊疗如肥达氏反映（Widalreaction）诊疗伤寒病。或运用血细胞凝集现象检查血型。2．间接凝集间接凝集（indirectagglutination）是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与对应抗体混合出现的凝集现象。如用γ球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。也能够将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒，一旦与含有对应抗原的脑脊液混合，便可发生凝集，可进行快速诊疗。故凝集反映即可测定抗原，也可测抗体，办法简便、敏感。3．抗球蛋白实验抗球蛋白实验（antiglobulintest,coombstest）的原理为间接凝集实验。例如应用于诊疗本身免疫溶血性贫血症时，Rh+红细胞与抗Rh血清间的反映。因抗Rh抗体是IgG只有两个结合价，分子较小（不如IgM结合价多，分子大）很难直接引发Rh+红细胞凝集。如果加入抗IgG的抗体，就可协助抗Rh的IgG的抗体凝集红细胞。也就是经抗Ig的作用提高凝集反映的敏捷度。（三）补体参加抗原抗体反映这一类反映重要涉及溶血反映（hemolyticassay）、补体介导的细胞毒实验（complementmediatedcytotoxicutytest）及补体结合实验（complementfixationtest）。1．溶血反映抗体与红细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反映中的补体活化，造成红细胞溶解，此办法可用于红细胞的多个抗原或对应抗体的检测，此法比凝集反映敏感。溶血反映也是用于抗体分泌细胞即空斑形成细胞（PFC）检测的原理。2．补体介导的细胞毒实验多个有核细胞与针对其表面抗原的抗体相遇，所形成的免疫复合物能活化反映中的补体，引发细胞膜穿孔，在一定时间内，细胞仍能维持一定的形态不破碎，加入水溶性染如伊红Y（eosinY）或台盼蓝（trypanblue）后，染料即可进入被活化补体穿孔的细胞，不带对应抗原细胞膜保持完整的活细胞不着色。此办法可用于带多个抗原的细胞的检测，如进行细胞MHC抗原的鉴定，和进行淋巴细胞中T细胞总数或其亚类的计数。在某些免疫学实验中也可用这种办法，根据需要特异地消除带某种抗原的细胞。3．补体结合实验当抗原（可溶性或颗粒性）与对应抗体结合，由于浓度低不出现可见反映时，应用补体结合实验可检出此抗原抗体反映，它比凝集反映或沉淀反映敏捷度高。本法涉及两个抗原抗体系统。一为检测系统由待检样品与已知抗原（或抗体）构成；另一为批示系统，由绵羊红细胞（SRBC）和抗SRBC构成。另加入作为补体的新鲜豚鼠血清。实验时试管中先加入检测系统和补体，混合经37℃30分钟使抗原、抗体、补体形成复合物，再加入批示系统，如出现溶血现象，阐明检测系统中没有相对应的抗原抗体，补体是游离的批示系统的SRBC和抗体结合而出现溶血，即为反映阴性。如不出现溶血，表明检测系统中有抗原抗体复合物并结合补体，则批示系统无多出的补体作用而没有溶血现象，即为阳性。在敏感的抗原、抗体检测办法（如酶标办法）出现之前补体结合实验曾广泛用于检测多个细菌、病毒或螺旋体（如梅毒）的抗原或抗体，由于本实验影响因素多，成果不稳定现已被新检测办法所替代。四、用标记抗体或抗原进行的抗原、抗体反映用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是广泛应用的敏感、可靠的办法。上述三种惯用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不变化后者的免疫特性。本办法可用于定性、定量或定位检测。1．免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescencetechni）是用化学办法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的对应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的办法。（1）直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反映后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有对应抗原存在，此法可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或病原菌的检查，也可用于组织中从容的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多个抗原，就需分别制备对应的多个标记抗体。（2）间接荧光法：可克服直接法需制备多个荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与对应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察成果与直接法相似。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体（图20-5）。图20-5免疫荧光直接法及间接法原理示意图免疫荧光技术在传染病诊疗上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM抗体，可做为近期接触抗原的标志，因此使用荧光标记抗IgM可诊疗近期感染。除微生物学方面的应用外，还可运用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activatedcellsorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞表面不同抗原，能够使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素（FITC）发黄绿荧光，用罗丹明（TMRITC）发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于本身免疫病的抗核抗体检查。2．放射免疫分析法放射免疫分析法（radioimmunoassayRIA）应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原（或抗体）与对应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断成果，本办法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法惯用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。放射免疫分析惯用的有液相法和固相法两种：（1）液相法：将待检标本（例如含胰岛素抗原）与定时的同位素标记的胰岛素（抗原）和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。在反映系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战性与胰岛素抗体结合。非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物越少。非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用原则的非标记抗原作成原则曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量（图20-6）。图20-6液相放射免疫分析法原理及原则曲线（2）固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性，惯用的固相载体有溴化氰（CNBr）海豹化的纸片或聚苯乙烯小管（图20-7）。图20-7固相放射免疫分析法原理放射免疫分析法应用范畴广泛，涉及多个激素（胰岛素、生长激素、甲状腺素等）维生素、药品、IgE等。3．酶联免疫分析法酶联免疫分析法（enzymeimmunoassay,EIA）是现在应用最广泛的免疫检测办法。本法将抗原抗体反映的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断实验成果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。惯用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)、碱性磷酶（alkalinephosphatase）等。它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶含有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。现在惯用的办法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者重要测定可溶性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，因此较放射免疫分析法易推广。图20-8生物素－酶标亲合素系统反映示意图（1）酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）:是与上述固相R