实验二 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定、霉菌的形态观察

新乡医学院三全学院实验课教案首页课程名称：微生物实验课授课教师姓名：杜晓娜助教授课题目实验二真菌的观察（酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定、霉菌的形态观察）授课对象2011级专科生物技术班时间分配（1）理论授课部分：实验目的，实验原理（10min）；实验步骤与操作（15min）；实验注意事项（5min）（2）实验操作部分：学生实验操作练习（90min）课时目标1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式2.学习鉴别死活细胞的实验方法。3.观察霉菌的形态特征授课重点酵母菌和霉菌的形态及繁殖方式；美蓝染液水浸片鉴定死活细胞的方法授课难点酵母菌和霉菌的形态观察及其繁殖方式授课形式小班授课授课方法板书理论讲解、指导学生实验操作练习参考文献教材：沈萍，陈向东．微生物实验（第四版），高等教育出版社，2007参考文献：１．沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验（第三版），高等教育出版社，1999２．吴坤，张世敏．微生物学实验技术，气象出版社，2004思考题1.描述实验结果，包括观察到的酵母菌形态以及死活细胞鉴定结果；2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌?教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字）课程负责人（签字）年月日年月日新乡医学院实验课教案单位:生命科学技术系发酵工程教研室任课教师：杜晓娜基本内容教学手段和时间分配实验二真菌的观察酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定、霉菌形态观察实验目的1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式2.学习鉴别死活细胞的实验方法。3.观察霉菌的形态特征4.进一步熟悉掌握无菌操作技术二、实验原理

1.酵母菌酵母菌是单细胞的真核微生物，形态与细菌类似，菌落表面光滑、大而突起、湿润、稍透明。菌体比细菌大而且不运动，是常见细菌的几倍到几十倍，在高倍镜下可以清楚看到。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水一碘液水浸片法来观察酵母的形态和芽殖方式。同时，采用美蓝染液水浸片法还可以对酵母的死、活细胞进行鉴别。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死的细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，本实验通过美蓝染液水浸片法观察酵母细胞形态和出芽生殖方式以及鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。（细胞之间单个分散或假丝状；球状、卵圆状或假丝状）2.霉菌霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。可以采用直接制片和透明胶带法观察，也可以采取载玻片培养观察法，通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在载玻片和盖玻片之间的培养基中生长，将培养物直接置于显微镜下可观察到霉菌自然生长状态并可连续观察不同发育期的菌体结构特征变化。对霉菌可利用乳酸石炭酸棉蓝染液进行染色，盖上盖玻片后制成霉菌制片镜检。石炭酸可以杀死菌体及孢子并可以防腐，乳酸可以保持菌体不变形，棉蓝使菌体着色。同时，这种霉菌制片方法不易干燥，能防止孢子飞散，用树胶封固后可制成永久标本长期保存。（菌落干燥、大而疏松或大而致密、不透明、颜色多样；细胞之间丝状交织）

三、试剂与器材

1.材料酵母菌、霉菌；

2.试剂吕氏碱性美蓝染色液，乳酸石炭酸棉蓝染液；

3.器材显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。

四、实验内容

1.酵母菌---美蓝染液水浸片法=1\*GB3①制片：载玻片中央滴加一滴0.1%美蓝染液，无菌操作下用接种环挑取少许酵母菌置于染液中，混合均匀；②染色：用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上，染色3min；③镜检：用低倍镜和高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据颜色区分死活细胞；④30分钟后再镜检观察，注意死活细胞数量是否发生变化。

2.霉菌---乳酸石炭酸棉蓝直接压片法观察①用牙签从霉菌琼脂平板培养物取下一块薄薄的琼脂块（要薄些），②50%酒精溶液中洗去脱落孢子③使用牙签将霉菌培养基放于载玻片上，加盖玻片④手指用力均匀按压2-3次，使霉菌平铺载玻片上，取下盖玻片，将培养基碎块挑出⑤滴加一滴棉蓝染液，加盖玻片吸水纸吸取多余染液⑥镜检：用低倍镜和高倍镜观察霉菌的形态

五、关键步骤及注意事项

①染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。

②用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。③用接种环将菌体与染料混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。④在直接制片观察过程中，用镊子和用解剖针取菌时要细心，尽量减少菌丝断裂及形态破坏，盖盖玻片时避免气泡产生。六、思考题1.绘制高倍镜下酵母菌和霉菌的形态特征图；2.30分钟后，酵母菌死活细胞的变化并分析原因。出芽繁殖：是酵母菌的主要无性繁殖方式；出芽繁殖的过程是在成熟的酵母菌细胞表面，向外突出形成芽体，然后部分核物质和细胞质进入芽体内。当芽体长到一定程度时，两细胞之间形成横壁，随后脱离母细胞，成为独立的新个体（子细胞）。→→→假菌丝：未脱落没细胞的芽细胞上又长出新芽。分裂繁殖：如易变裂殖酵母，当细胞长到一定大小时，核先分裂为二，接着形成隔膜将细胞分开，成为两个子细胞。（裂殖与细菌类似）将出芽繁殖用图画出，使学生可以形象的理解，并有目的的进行观察染液：染液适量，不宜过多或者过少，否则用盖玻片覆盖时，染液过多则会溢出，过少则会产生大量气泡混合：由于细胞较大，用接种环将菌体与染料混合时不要剧烈涂抹，