第三章 核酸分子的分离提取与酶处理

第三章

核酸分子的分离提取与酶处理本章内容第一节核酸的分离纯化第二节DNA分子的酶切第三节DNA分子的链接第四节DNA分子的修饰第一节核酸的分离纯化核酸的分离纯化是获得目的基因及载体DNA片段的基本途径，核酸分离的好坏直接决定了核酸样品的质量。一、核酸分离提取的原则与要求核酸分离纯化总的原则是要保证核酸一级结构的完整性，防止降解，同时要排除其他分子的污染。对于核酸的纯化应达到以下三点要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其他生物大分子，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。二、核酸提取的主要步骤1.样品准备新鲜的动植物组织材料，经清洗去掉非组织材料杂质。植物：液氮冻结，然后快速碾磨成粉末状；动物细胞：胰酶消化，再离心沉淀，收集细胞；微生物：离心沉淀收集菌体。二、核酸提取的主要步骤2.细胞破碎细胞的破碎有各种方法，包括物理方法、化学方法、酶法等。常见的物理方法有超声波法、均浆法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。缺点：容易导致DNA链的断裂。化学方法和酶法，如采用去污剂十二烷基硫酸钠(SDs)和溶菌酶或蛋白酶K，在Tris-HCl(pH8.0)的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中，温和裂解。DNA中RNA和RNA中DNA的去除。二、核酸提取的主要步骤3.分离纯化核酸核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质，要将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。二、核酸提取的主要步骤3.分离纯化核酸核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质，要将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。二、核酸提取的主要步骤4.核酸的沉淀浓缩常用的是乙醇沉淀法。加入1/10体积的乙酸钠(3mol/LpH=5.2)于DNA溶液中充分混匀；加入2.5倍体积预冷的乙醇，混合后，置于20℃中15~30min；12000rpm离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；加入离心管容量的75%乙醇，12000rpm离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；室温下，浆开盖的EP管的置于实验桌上5min，使残留的液体挥发至干；加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。三、质粒DNA的分离纯化1.碱裂解法碱裂解法是小量制备DNA较好的方法。原理：利用质粒DNA分子较小，且为超螺旋共价闭合环状的结构特点，它与分子较大的染色体DNA有很大差异。利用这种差异可以将它们分离，即在碱性pH(12~12.5)下，DNA分子均变性；恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能准确复性，就与其他成分共沉淀；而质粒DNA分子小且两条闭合环状分子即使变性也较紧密地缠绕在一起，准确复性而留于上清溶液中。三、质粒DNA的分离纯化1.碱裂解法碱裂解法是小量制备DNA较好的方法。原理：三、质粒DNA的分离纯化2.煮沸法沸法是利用加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却是即恢复期天然构象，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在于液相中，通过高速离（12000g）心将两者分开。然后可用5%CTAB选择性沉淀DNA。三、质粒DNA的分离纯化3.CsCl-EB密度梯度平衡离心CsCl是一种大分子量的重金属盐，长时间超速离心时，在管中形成1.0000-1.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。含有细胞裂解液的体系在长时间超速离心平衡后，DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡，染色体DNA、质粒、RNA以及蛋白质等不同浮力密度的物质可在管内不同位置形成区带。RNA可与Cs+结合，密度最大，沉积管底，蛋白质漂浮于液面上。三、质粒DNA的分离纯化3.CsCl-EB密度梯度平衡离心用含氯化铯和溴化乙锭的悬浮密度梯度离心法分离质粒和染色体DNA的方法，取决于与线状DNA和闭环DNA结合的溴化乙锭的量的差异。3.CsCl-EB密度梯度平衡离心（CsCldensity-gradientcentrifugation）三、质粒DNA的分离纯化根据质粒大小和结构与基因组DNA的区别，还可以采用阴离子交换色谱或分子筛色谱，还可以选用一些商业化的柱子，凝胶电泳也是一种分子不同分子量DNA的手段。三、质粒DNA的分离纯化4.DNA的纯化对于一些DNA纯化要求高的实如哺乳类动物细胞转染、转基因动物操作等，需要进一步提高质粒DNA的纯度。可采取以下方法：①CsCl梯度平衡超速离心法；②离子交换或凝胶过滤柱色谱法；③分级聚乙二醇沉淀法；④琼脂糖凝胶电泳片段分离法。四、基因组DNA的制备基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。可采取以下方法：①SDS法；②十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法；③其他，试剂盒。四、基因组DNA的制备五、RNA的提取RNA是目前发现的细胞内生物功能最丰富多样的生物大分子，同时也是DNA与蛋质信息传递的桥梁，因此完整RNA的提取和纯化是功能基因组时代的重要手段。如Northern杂交、mRNA分离、cDNA的合成及体外翻译都是以高质量RNA为基础。原核生物的rRNA分三类:5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四类:5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。真核生物的28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA。土壤宏转录组RNA的提取五、RNA的提取所有RNA的提取过程都有五个关键：①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性解离，释放出RNA；③对RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。但其中最关键的是抑制RNA酶的活性。六、核酸的定量核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重要手段。常见的方法有紫外分光光度法及荧光分光光度法。六、核酸的定量1.紫外分光光度法核酸的最大吸收波长是260nm,10D值的光密度相当于双链DNA浓度为50

g/mL，单链DNA或RNA为40

g/mL，单链寡核苷酸为20

g/mL。通过测定在260nm和280m处的紫外吸收值的比值(OD260/OD280)来估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，若DNA样品的比值高于1.8，说明其中的RNA尚未除尽，比值小于1.8则说明残留酚或蛋白质。六、核酸的定量1.紫外分光光度法RNA的比值为2.0。当比值为1.8~2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的。当R<1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。六、核酸的定量2.荧光分光光度法DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。六、核酸的定量2.荧光分光光度法DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。溴化乙锭（EB）SYBRGreenIGoldViewGelRed七、核酸的凝胶电泳电泳是利用带电荷物质在电场中迁移速率的不同将其分离的方法，而凝胶电泳利用了支持介质形成的网状结构使不同大小的大分子物质得以分离并保留于凝胶中，在不同位置形成条带。电泳迁移率的大小与物质的带电量与分子量的比值(荷质比)相关在中性pH值或碱性缓冲液中，核酸分子骨架上的磷酸基团在水中的解离带有负电荷，在电场中由负极向正极迁移。七、核酸的凝胶电泳1.琼脂糖凝胶电泳不同浓度的琼脂糖凝胶电泳可分辨不同大小范围的DNA片段，对于双链DNA来说，DNA片段在500~60,000bp用琼脂糖凝胶分离。GeneRuler™100bpDNALadderPlus脉冲场电泳(PulsedFieldGelElectrophoresis,PFGE)施加至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。七、核酸的凝胶电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于DNA、蛋白质等的分离。核酸片段小于1000bp用聚丙烯酰胺凝胶，含高浓度尿素（7M）的变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离短的(<500bp)单链DNA或RNA。七、核酸的凝胶电泳3.凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化需将得到的含有目的基因的DNA片段以及提纯的质粒闭环DNA，再用合适的限制性内切酶分别把它们切开，用凝胶电泳把酶切后的不同片段分开，从凝胶中回收所需的目的基因片段和载体DNA的线性片段，并加以必需的纯化，特别是去除琼脂糖，排除其对DNA连接酶的抑制。七、核酸的凝胶电泳3.凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化从琼脂糖凝胶中回收人们需要的DNA片段的方法有很多：电泳洗脱法、DEAE纤维素膜插片法、低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法、冻融法、玻璃奶法、QIAEX法。第二节DNA分子的酶切3用于基因转移的受体菌或细胞2用于基因克隆的载体1用于核酸操作的工具酶基因工程的必要条件核酸酶是一类能够水解相邻两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，使核酸分子断裂的一类酶。核酸酶底物核糖核酸酶(RNase)，特异性水解断裂RNA链，如RnaseH脱氧核糖核酸酶(DNase)，专门水解断裂DNA链，如DNaseI核酸酶位置底物核糖核酸酶(RNase)，特异性水解断裂RNA链，如RnaseH脱氧核糖核酸酶(DNase)，专门水解断裂DNA链，如DNaseI核酸外切酶(exonuclease)，从核酸分子的末端开始，逐个消化降解多核苷酸链核酸内切酶(endonuclease)，从核酸分子的内部切割3′,5-磷酸二酯键，使核酸链断裂成更小的片段常用的工具酶：序号工具酶作用方式1限制性核酸内切酶切割DNA2DNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键3DNA聚合酶复制DNA4反转录酶cDNA合成5碱性磷酸酶切除末端磷酸基6多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记7DNaseI水解断裂DNA8RNaseH水解断裂RNA一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）限制性核酸内切酶是一类识别双链DNA内部特定核苷酸序列的DNA水解酶。它们以内切的方式水解DNA，产生5’-P和3’-OH末端。一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）1、限制性核酸内切酶的发现瑞士人Arber的团队采用放射性同位素标记发现，在噬菌体入侵宿主细胞时，进入细胞内的噬菌体DNA被降解掉，而宿主自身的DNA未被降解。因此，他们提出了限制-修饰(R-M)假说，认为细菌等一些原核生物体内存在一种可保护自身免于外来DNA(如噬菌体)侵入的防卫系统。限制修饰系统(restrictionmodificationsystem)该系统包括限制和修饰两个方面的作用。限制(restriction)是指细菌的限制性核酸酶对入侵DNA的降解作用，这就限制了外源DNA侵入所造成的危害。修饰(modification)是指细菌的修饰酶对于自身DNA碱基分子的甲基化等化学修饰作用，经修饰酶修饰后的DNA分子可免遭细菌限制酶的降解作用。寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的：1、修饰的甲基转移酶，2、核酸内切限制酶。寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的：1、修饰的甲基转移酶，2、核酸内切限制酶。寄主控制的限制与修饰的作用：1、保护自身的DNA不受限制；2、破坏外源DNA使之迅速降解。根据限制-修饰现象发现的核酸内切限制酶，现在已成为重组DNA技术的重要工具酶。限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用1965年，Arber提出了生物体内存在具有切割基因功能的限制性内切酶。1968年成功分离出I型限制性内切酶，但这种酶的切割基因功能不理想。1970年，美国分子生物学家、遗传学家H.O.Smith分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D.Nathans使用II型限制性内切酶首次完成了对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现人工基因重组提供了有效的技术手段。一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、限制性核酸内切酶的类型和命名限制性核酸内切酶的命名规则属名种名

株名HindI，HindII，

HindIIIHaemophilus

influenzae

d

嗜血流感杆菌d株（3）同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)（1）HindIII（2）EcoRⅠ一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列II型限制性内切酶一般能够识别4-8个脱氧核苷酸的序列。一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列（2）识别序列都是回文结构5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列（2）识别序列都是回文结构5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列（2）识别序列都是回文结构（3）切割后形成各种黏性末端或平末端粘性末端与平头末端互补性粘性末端之间碱基配对促使连接反应容易进行。平端之间连接反应效率很低，提高DNA连接酶和DNA片段浓度等措施可以使反应效率增强。粘性末端与平头末端特点由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，故在II型限制性内切酶是基因工程中主要的限制酶。二、限制性核酸内切酶切割DNA的方法

II

型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.510mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量MgCl2II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的双酶解：位置影响对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5‘GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’共用位点相互干扰II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的双酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作酶切回收：0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥三、影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等（1）加大酶的用量，1mgDNA用10U酶（2）加大反应总体积（3）延长反应时间2.DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的Dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响

。

大肠杆菌中的Dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等A：B：3.核酸内切酶的缓冲液性质：缓冲液成分：氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。3.核酸内切酶的缓冲液性质：如：EcoRI在正常条件下识别并切割5’-GAATTC-3’序列，但在pH7.5变为8.5，甘油浓度超过5%（v/v），或用Mn2+代替Mg2+时，EcoRI识别序列变为

5’-AATT-3’。

这使得该酶在DNA分子上的切割位点数量增加，产物片段变短。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况，例如SmaⅠ是25℃、MaeⅠ是45℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。4.酶切消化反应的温度DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。5.DNA的分子结构用UniversalBuffer和BasalBuffer进行限制酶活性表示甲基化对限制酶活性的影响DoubleDigestion（双酶切反应）和UniversalBuffer（通用缓冲液）的使用表用DNAman对DNA序列进行酶切位点分析单/双酶切举例二、实验程序：假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点,且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果,则单酶切应为一条带,而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开三、结果与分析：M：DL2000marker1:重组质粒

第三节DNA分子的连接3用于基因转移的受体菌或细胞2用于基因克隆的载体1用于核酸操作的工具酶基因工程的必要条件DNA连接酶催化单链或双链DNA分子的连接修复，其作用位点位于DNA分子内或分子间相邻核苷酸的3′-羟基和5′-磷酸间形成共价的磷酸二酯键，使原先断裂的DNA连接起来。连接酶(ligase)是一类能将两个核酸片段连接起来的酶。一、连接酶根据连接酶来源：1.E.

coliDNA连接酶，大肠杆菌；2.T4DNA连接酶，T4噬菌体；3.热稳定DNA连接酶和T4RNA连接酶，T4噬菌体。连接酶种类DNA连接酶(DNAligase)借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA中相邻的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键，在基因工程中用来将不同来源DNA链进行连接，形成重组DNA。在基因工程中常用到的DNA连接酶主要是E.

coli

DNA连接酶和T4DNA连接酶。一、连接酶T4DNA连接酶可催化DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA黏性末端或平末端之间的连接反应。连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃。T4DNA连接酶T4DNA连接酶与大肠杆菌连接酶相比在基因工程中的应用更方便一些，主要用于：①修复双链DNA上的单链缺口(与大肠杆菌DNA连接酶相同)，这是两种DNA连接酶都具有的基本活性；②连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，前者反应速度较快；③连接两个平末端双链DNA分子。T4DNA连接酶二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；黏性末端二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；第二类是平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；第二类是平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；第三类是多聚脱氧核苷酸接尾连接，用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA片段加上多聚脱氧核苷酸尾后，再用DNA连接酶将它们连接起来；二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；第二类是平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；第三类是多聚脱氧核苷酸接尾连接，用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA片段加上多聚脱氧核苷酸尾后，再用DNA连接酶将它们连接起来；第四类是接头连接，在平端DNA片段末端加上化学合成的接头(

linker)而形成黏性末端，再用DNA连接酶将各黏性末端DNA片段连接起来。三、平末端DNA片段的连接1.平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；2.同聚物加尾法，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能，可以在DNA分子3’-OH端连续添加一系列的核苷酸，如polyA或polyT；3.接头连接，在平端DNA片段末端加上化学合成的接头(

linker)而形成黏性末端，再用DNA连接酶将各黏性末端DNA片段连接起来。四、影响连接反应的因素很多因素都会影响到连接反应的效率，主要包括：（1）温度，T4DNA连接酶最适温度是37℃，室温25℃，16℃或4℃过夜；（2）DNA末端的性质，平末端，粘性末端；（3）DNA片段的大小和浓度，DNA片段的摩尔比为1:3

~1:10；四、影响连接反应的因素很多因素都会影响到连接反应的效率，主要包括：（1）温度，T4DNA连接酶最适温度是37℃，室温25℃，16℃或4℃过夜；（2）DNA末端的性质，平末端，粘性末端；（3）DNA片段的大小和浓度，DNA片段的摩尔比为1:3

~1:10；（4）离子浓度，Mg2+、ATP等，Ligasebuffer。DNA连接酶2.DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlLT4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量第四节DNA分子的修饰第四节DNA分子的修饰DNA修饰酶类有：1、末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT），又称末端转移酶2、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）3、T4