第四章 基因工程载体

第四章基因工程的载体本章内容第一节质粒载体第二节噬菌体载体第三节酵母载体第四节Ti质粒表达载体第五节病毒表达载体第六节人工染色体载体携带外源基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的运载工具称之为载体(

vector)，其本质是DNA(少数为RNA)，如质粒DNA、病毒DNA、cos质粒等载体。①在宿主细胞中能自我复制，即本身是复制子；②容易从宿主细胞中分离纯化；③载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域、插在其中的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增；④有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装；⑤能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；⑥用于表达目的基因的载体还应具有启动子(强启动子)、增强子、SD序列、终止子等表达元件。基因工程应用的载体通常需具有如下特性：克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段，有一个松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。

克隆载体可分为：质粒载体(plasmidvector)、噬菌体载体(phagevector)、人工染色体(artificialchromosome)等。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，才能使外源基因在宿主细胞中有效地表达。载体按功能可分为克隆载体和表达载体两种基本类型：第一节质粒载体质粒的构建分子量大、拷贝数低、酶切位点少、遗传标记不理想，不能满足克隆载体的要求。需要进行人工构建。几种野生型质粒：pSC1018.8kb，拷贝数5，四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20–30，大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因Apr天然质粒的缺陷：一、质粒的一般生物学特征质粒的概念定义：质粒(

plasmid)是存在于细胞质中的一类独立于染色体的可自主复制的遗传成分，绝大多数质粒为共价闭合环状DNA(covalent

closed

circular

DNA，cccDNA)，少数是线性。存在：质粒不仅仅存在于原核生物中，也存在于真核生物及其细胞器中。核酸类型：绝大多数的质粒是DNA型的。大小：质粒DNA的分子量范围：1-300kb。一、质粒的一般生物学特征2.质粒DNA的构型①如果两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，通常呈现超螺旋构型(supercoiledDNA，SCDNA)；②如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(opencirclesDNA，OCDNA)，此即OC构型；③若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子(linearDNA，LDNA)，通称L构型。一、质粒的一般生物学特征2.质粒DNA的构型一、质粒的一般生物学特征3.质粒DNA的复制质粒在细胞内的复制一般有两种类型：严紧控制型(stringentcontrol)：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。松弛控制型(relaxedcontrol)：松弛型质粒是一种高拷贝数质粒，在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，甚至多达数百个。如ColE1质粒。通常小质粒为松弛型质粒，大质粒为严紧型质粒。质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRepVectorsCopyNumberoripUC~500-700pMB1(derivative)pBR322~15-20pMB1pET~15-20pBR322pGEX~15-20pBR322pColE1~15-20ColE1pR6K~15-20R6KpACYC~10p15ApSC101~5pSC101pBluescript~300-500ColE1(derivative)andF1pGEM~300-500pUCandF1常见质粒载体拷贝数及其复制子一、质粒的一般生物学特征4.质粒的不相容性（不亲和性）含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容含有相似复制子结构的质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的控制，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。质粒的不相容性的分子机制：一、质粒的一般生物学特征5.质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用，如

ColE1非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。一、质粒的一般生物学特征6.携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义一、质粒的一般生物学特征7.质粒的命名原则新发现或改造的质粒命名第1个小写字母p表示质粒(plasmid)，后面2个或3个大写字母表示构建该质粒的研究人员的姓名或实验室名称，最后的数字表示构建的一系列质粒的编号。pBR322plasmidF.BoliverR.L.RodriguezLabNo.二、理想质粒载体的必备条件(1)具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核生物复制子，另一个为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。(2)带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源DNA片段定点插入。多克隆位点(multiplecloningsite，MCS)。(3)具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的遗传表型特征。常用的选择标记基因主要是抗生素的抗性基因和

-半乳糖苷酶基因。(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数。(5)基因工程所应用的质粒通常为非传递性的松弛型质粒，安全可控，不至于对操作者和环境带来不必要的危害。质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因，拷贝数100-1000，扩增基因低拷贝质粒来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20表3-1

：质粒载体及其拷贝数质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因，拷贝数100-1000，扩增基因低拷贝质粒来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件三、常用的质粒载体

1977年，加州大学旧金山分校的F.Bolivar和R.L.Rodriguez构建了一个典型的用于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用广泛的许多质粒载体几乎都是由此发展而来的。pBR322质粒DNA分子的大小为4363bp。具有ColEI松弛型复制子，在每个E.coli细胞中维持约20个拷贝。含有选择标记基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）。1.pBR322质粒载体大肠杆菌pBR322质粒载体的结构图pMB1pSF2124pSC101pBR322质粒载体具有如下优点：①具有较小的分子量。pBR322质粒DNA分子的长度是4363bp，这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段(一般可接受小于6kb的外源DNA)。②具有两种抗生素抗性基因（tetr,ampr），供作转化子的选择记号。可以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。③具有较高的拷贝数。经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这为重组体DNA的制备提供了极大的方便。三、常用的质粒载体

1983年，美国UniversityofMinnesota的科学家JanNorrander,TomasKempe和JoachimMessing在pBR322质粒框架基础上构建的一种广泛使用的新型质粒载体即pUC系列质粒载体pUC18/19。2.pUC质粒载体pUC18/19：拷贝数500-700/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记

lacZ’重要的大肠杆菌质粒载体pUC系列质粒载体通常包括以下四个组成部分：①来自pBR322质粒的复制起点(ori)，pUC质粒缺乏rop基因，在正常情况下，该基因紧靠DNA复制起点，与控制拷贝数有关。缺乏rop基因的结果是，这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或CoEl)复制起点的质粒高得多。因而在细菌培养物中无须加入氯霉素来提高其拷贝数。②氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但其核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶切割位点。③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码a-肽链的DNA序列。pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段a

X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷宿主细胞pUC18/19PlaclacZMCSa-肽a

X-gal目的基因宿主细胞正选择标记lacZ’的显色原理（a-互补作用）？？？？pUC系列质粒载体通常包括以下四个组成部分：①来自pBR322质粒的复制起点(ori)，pUC质粒缺乏rop基因，在正常情况下，该基因紧靠DNA复制起点，与控制拷贝数有关。缺乏rop基因的结果是，这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或CoEl)复制起点的质粒高得多。因而在细菌培养物中无须加入氯霉素来提高其拷贝数。②氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但其核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶切割位点。③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码a-肽链的DNA序列。④位于lacZ基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点(MCS)区段，但它的存在并不破坏该基因的功能。MCS是含有多种限制酶的单识别位点的一段核苷酸序列，便于外源基因的插入MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。pUC质粒载体的优点有三个主要方面：①具有更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多，如pUC18为2686bp。Rop蛋白质的缺失使得pUC质粒的拷贝为500~700个。②适用于组织化学方法检测重组体。pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的a肽链可参与a-互补作用。因此，可用X-gal显色的组织化学方法步实现对重组体转化子克隆的鉴定，从而节省时间。③具有MCS区段。pGEM-3Zf(+)多拷贝（~300-500）装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱裂解法质粒DNA纯度低、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒DNA的分离纯化1、氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜（16-48h）在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs质粒DNA的分离纯化2、碱裂解法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNA质粒DNA的分离纯化3、沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA质粒DNA的分离纯化4、试剂盒Kit质粒DNA的分离纯化Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能在PCR扩增产物的3`-端自动添加一个3`-A突出末端利用这个原理，制造有5`-端单个T碱基的载体在连接酶作用下，PCR产物3`-A和T载体的5`-T碱基互补配对形成TA克隆T-A克隆载体T-A克隆载体TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理不需在PCR扩增产物上加接头可直接进行克隆。T-A克隆优点第二节噬菌体载体噬菌体噬菌体（bacteriophage，简称phage）是一类细菌病毒的总称。它是一类非细胞微生物，能高效率高特异性侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体M13phage

phage噬菌体由遗传物质核酸及其外壳组成。噬菌体颗粒外壳是蛋白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链RNA等多种形式。噬菌体噬菌体由遗传物质核酸及其外壳组成。噬菌体颗粒外壳是蛋白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链RNA等多种形式。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差可达上百倍。不同种类的噬菌体颗粒在结构上差别很大，可分为三种类型。大多数噬菌体是具尾部结构的二十面体，头部下端连接着一条尾部结构，看起来像是一种小型的皮下注射器，如T4噬菌体。另两种类型是无尾部结构的二十面体型和线状体型。噬菌体噬菌体M13phage

phage噬菌体噬菌体或病毒载体特性：高效率的感染性——使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性——使外源基因在受体细胞中高效扩增

噬菌体生物学特性：感染周期

噬菌体生物学特性：溶菌周期和溶源周期在溶菌周期中，噬菌体DNA注入细菌细胞后，噬菌体DNA大量复制，并合成出新的头部和尾部蛋白质，头部蛋白质组装成头部，并把噬菌体的DNA包裹在内，然后再同尾部蛋白质连接起来，形成子代噬菌体颗粒，最后噬菌体产生出一种特异性的酶，破坏细菌细胞壁，子代噬菌体颗粒释放出来，细菌裂解死亡，这种具有溶菌周期的噬菌体被称为烈性噬菌体（virulentphage）。在溶源周期中，噬菌体的DNA进入细菌细胞后，并不马上进行复制，而是在特定的位点整合到宿主染色体中，成为染色体的一个组成部分，随细菌染色体的复制而复制，并分配到子细胞中而不会出现子代噬菌体颗粒。但是，这种潜伏的噬菌体DNA在某种营养条件或环境条件的胁迫下，可从宿主染色体DNA上切割下来，并进入溶菌周期，细菌同样也会因裂解而致死，释放出许多子代噬菌体颗粒。把这种既进入溶菌周期又能进入溶源周期的噬菌体称为温和噬菌体(temperatephage)，又称溶原性噬菌体（lysogenicphage）。

噬菌体生物学特性：溶菌周期和溶源周期溶源性噬菌体的生命周期（引自吴乃虎，1998）二、λ噬菌体载体λ噬菌体载体（lambdaphagevector）是最早使用的克隆载体之一，也是迄今为止研究的最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体，在重组DNA的研究中有着相当广泛的应用。二、λ噬菌体载体λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。由DNA（λDNA）和外壳蛋白质组成。外形特征类似于蝌蚪，由头和尾组成。1.λ噬菌体载体的生物学特性λ噬菌体DNA是一条线性双链DNA分子，长度为48502bp。在其两端的5

末端各带有一个长为12个碱基（序列为5-GGGCGGCGACCT-3

）的单链互补黏性末端。一旦进入宿主细胞，黏性末端互补配对形成双链环状DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点（cohesiveendsite）。随后环状DNA的两切口在宿主细胞的DNA连接酶和促旋酶的作用下，形成封闭的环状双链，充当转录的模板。二、λ噬菌体载体λ噬菌体DNA分子的cos位点

l噬菌体基因组DNA上至少有61个基因，其中有一般左右参与了噬菌体生命周期活动，这类基因称为l噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，这类基因称为非必需基因。二、λ噬菌体载体5’GGGCGGCGACCTG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA重组区调控区头部区尾部区

噬菌体生物学特性：生物结构λgtWESλB噬菌体载体的构建

l噬菌体基因组DNA上至少有61个基因，其中有一般左右参与了噬菌体生命周期活动，这类基因称为l噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，这类基因称为非必需基因。

噬菌体具有溶菌周期和溶源周期两种生长途径。二、λ噬菌体载体前噬菌体（pre-phage）大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：

溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态噬菌体二、λ噬菌体载体2.λ噬菌体载体的构建在基因工程中，λ噬菌体载体是最主要的一种载体。然而野生型的λ噬菌体并不适于直接用作基因克隆的载体，一方面λDNA基因组大而且复杂，特别是其中具有多个基因克隆常用的限制酶识别位点（如5个BamH

I位点、6个BglⅡ位点和5个EcoR

I位点等）；另一方面λ噬菌体外壳只能接纳相当于基因组大小的75％～105％的DNA分子。二、λ噬菌体载体2.λ噬菌体载体的构建对野生型的λ噬菌体的改造主要包括以下几个方面：（1）去除λDNA非必需区，增加承载外源DNA片段的容量。这是改造λDNA的首要目标。为此，可以删除λ噬菌体的非必需区，使λ噬菌体载体可插入5～20kb的外源DNA片段，而不影响其感染力。（2）去除多余的限制酶切割位点，确定1～2个单酶切位点作为克隆位点。因此，在构建克隆载体时，对于某种限制性内切酶来说，只能保留1～2个单酶切位点作为克隆位点，用于插入或替换外源DNA片段，而必需区内的这种酶的识别序列必须用点突变或甲基化酶处理等方法使之失效。二、λ噬菌体载体2.λ噬菌体载体的构建对野生型的λ噬菌体的改造主要包括以下几个方面：（3）λDNA的非必需区装入选择标记基因，以方便对重组子进行筛选。在λ噬菌体载体中主要利用λ噬菌体的生物学特性来做选择标记。主要有cI基因失活、Spi筛选、lacZ基因失活。（4）建立重组的λDNA分子的体外包装系统，高效的感染受体细胞。λ噬菌体改造成为基因工程中用的载体，目的是把外源DNA片段插入载体中，并使它导入受体细胞。这种由寄主细胞捕获噬菌体（病毒）DNA的过程为转染。若以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程，特称为转导。而将质粒等外源DNA制剂引入细胞的过程，称为转化。二、λ噬菌体载体3.λ噬菌体载体种类随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展，人们已经构建了许多λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：插入型载体（insertionvector）和置换型载体（replacementvector）。二、λ噬菌体载体3.λ噬菌体载体种类（1）插入型载体通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertionvectors）。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度---插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：6

-11

kb噬菌体二、λ噬菌体载体3.λ噬菌体载体种类（1）插入型载体，通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertionvectors）。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。（2）置换型载体，允许外源DNA片段替换非必需DNA片段的载体，称为置换型载体，又称取代型载体（subtitutionvectors）。大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度---取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb噬菌体二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmidvector）是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体，也称为粘粒载体，即由质粒和λ噬菌体的粘性末端构建而成。借用cos-（粘性尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称cosmid。柯斯质粒是1978年J．Coffins及B．Hohn等人发明的，比λ噬菌体具有更大的克隆能力，在真核基因的克隆中起到了巨大的作用。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（1）柯斯质粒载体的构成柯斯质粒载体是一种环状双链DNA分子，大小为4～6kb。它由4部分组成，包括质粒的复制起点、一个或多个限制性核酸内切酶的单一切割位点、抗性标记基因和λ噬菌体的黏性末端片段。柯斯质粒载体pHC79的结构图pHC79(6kb)二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。由于柯斯质粒载体不含λ噬菌体裂解生长、溶源性途径和DNA复制系统，所以不会产生子代噬菌体。但是，此载体含有一个cos位点，在A蛋白的作用下，cos位点被切开，提供体外包装必需的cos末端。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。进入宿主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。但由于柯斯质粒载体不含有入噬菌体的全部必要基因，因此它不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在宿主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗生素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子一般只有5~7kb。按λ噬菌体的包装限制(38~52kb)，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成为噬菌体颗粒的最大外源DNA片段可达45kb左右。同时，由于包装限制的缘故，柯斯质粒载体的克隆能力还存在着一个最低极限值。如果柯斯质粒载体自身大小为5kb，那么插入的外源DNA片段至少得有33kb，才能包装形成具有感染性的噬菌体颗粒。由此可见，柯斯质粒载体适于克隆大片段的DNA分子。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。柯斯质粒载体能与共存于同一寄主细胞中的带有共同序列的质粒进行重组，形成共合体。当一个柯斯质粒载体与带有不同抗生素标记的质粒转化同一宿主细胞时，便可筛选到具有相容性复制起点的共合体分子。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（3）柯斯质粒载体进行基因克隆的基本程序M13噬菌体M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13噬菌体M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13噬菌体DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA片段，也不会影响其复制，这为构建克隆载体提供了条件。M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染F+的大肠杆菌。感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，但抑制宿主细胞的生长。M13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ’polylinkerM13噬菌体大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，这在DNA定向突变中非常有用。M13重组分子筛选简便。被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb。噬菌体可以克隆双链DNA分子中的每一条链。可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC118pUC18+M13间隔区IGpUC119pUC19+M13间隔区IG500个拷贝MCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/1193200bp噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒载体：pBluescript体外转录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT7MCSlacZ’PT7oriAprf1-oriPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录pBluescript2958bp噬菌粒（phagemidorphasmid）FosmidsaresimilartocosmidsbutarebasedonthebacterialF-plasmid.Thecloningvectorislimited,asahost(usuallyE.coli)canonlycontainonefosmidmolecule.Lowcopynumberoffershigherstabilitythancomparablehighcopynumbercosmids.Fosmidsystemmaybeusefulforconstructingstablelibrariesfromcomplexgenomes.FosmidcloneswereusedtohelpassesstheaccuracyofthePublicHumanGenomeSequence.FosmidFosmidFosmid文库具有以下优点:

Fosmid载体含有大肠杆菌的F因子，从而保证了单拷贝克隆，高稳定性；Fosmid载体含有高拷贝复制起始位点oriV，诱导后可实现高拷贝表达（50个），有利于后续筛选工作的开展；独特的包装过程使得大小在35-45kb之外的DNA片段均不能被插入到载体上，从而降低了Fosmid文库的假阳性；随机性好，保证了每段DNA在文库中出现的频率均等。OverviewoftheCopyControl™System.

第三节酵母载体酵母(

saccharomyce)是研究真核生物DNA的复制、重组、基因表达及调控等过程的理想材料。在基因克隆实验中，酵母是真核生物常用的受体细胞。在酿酒酵母(S.

cerevisiae)的大部分品系中都发现了质粒的存在，即2

m质粒，是所有真核生物染色体外遗传因子研究得最多、最深入的一种质粒。该质粒是一闭合环状双链DNA分子，长度为2

m，分子大小约为6300bp，通常与蛋白质结合构成复合物。酵母酿酒酵母中的2mm环状质粒酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的2mm环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有2mm双链同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2mm质粒类似。酵母菌中的野生型质粒人们已构建了许多酵母质粒载体，根据质粒的复制方式不同，把它们分为：（1）整合型载体(integrativeyeastplasmidvectors，Ylp)（2）复制型载体(yeastreplicatingplasmidvectors，YRp)（3）着丝粒型载体(yeastcentromere-containingplasmidvectors或yeastcentromereplasmidvectors，YCp)（4）附加体型载体(又称游离型质粒，yeastepisomalplasmidvectors或yeastextrachromosomalplasmidvectors，YEp)等。酵母载体尿嘧啶自养型基因整合型质粒附加体型质粒人工酵母染色体酵母染色体DNA自主复制序列酵母染色体着丝粒基因酵母染色体DNA的端粒pBR322以上几种类型的载体，它共同的特点是：①能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增。②含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如Leu2+、His+、URA3+、Trp+等。有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗性标记。③含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。一、整合型载体（YIp）

YIp型载体比较简单，属于穿梭质粒、自我复制型载体，由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColE1质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成。由于Leu2+基因片段不含自主复制起始区，只作为选择标记。所以YIp型载体在酵母细胞中不能自主复制。一、整合型载体（YIp）

YIp型载体含有4个主要部分：①多克隆位点；②抗氨苄青霉素基因

Ampr；③大肠杆菌复制起点pMB1ori；④尿嘧啶自养型基因URA3，在酵母菌第V染色体上有URA3的同源顺序，通过交换可将YIP整合到第V染色体中。

YIp5载体的结构示意图一、整合型载体（YIp）

YIp型载体可经转化作用导入受体细胞，进入细胞后的YIp质粒DNA通过与受体染色体DNA的同源重组，被整合到染色体上，并随染色体一起复制。这样质粒DNA以单拷贝基因形式稳定地遗传。YIp型载体的特点是转化率低（1-10转化子/

gDNA），但是转化子稳定，多用于遗传分析工作。二、复制型载体（YRp）YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，其中酵母DNA片段不但提供了选择标记，还携带有来自酵母染色体DNA的自主复制序列（ARS）。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制，这种载体又称为穿梭载体（shuttlevector）。所谓穿梭载体，是指可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体，含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类宿主中繁殖，在原核生物和真核生物细胞中都能复制和表达。YRp7载体的结构示意图二、复制型载体（YRp）YRp型载体对酵母的转化率极高(102-103转化子/gDNA)，拷贝数也较高。由于YRp质粒以cDNA分子形式存在，故很容易从酵母中提取到。但在受体细胞中不稳定，容易丟失，这是它的缺点。若在YRp型质粒中插入酵母染色体的着丝粒区（CEN4），则构成了酵母着丝粒型载体YCp，由于着丝粒区的作用，这类载体在供体细胞中的行为类似染色体，能够稳定遗传，但以单拷贝存在，因此由供体细胞重新获得YCp质粒则比较困难。YCp507.95kb三、附加体型载体（YEp）YEp型载体是一种罕见的真核细胞质粒载体，一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色体的选择标记构成。YEp24载体就是由酵母的2µm质粒、pBR322质粒和酵母的URA3基因构成的。YEp型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转化子/

gDNA。比YRp型质粒更稳定，拷贝数也高（25～100个/细胞），是基因克隆中常用的载体。YEp24载体结构示意图尿嘧啶自养型基因整合型质粒附加体型质粒人工酵母染色体酵母染色体DNA自主复制序列酵母染色体着丝粒基因酵母染色体DNA的端粒pBR322第四节Ti质粒表达载体一、Ti质粒的结构Ti质粒(tumorinducingplasmid)存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。冠瘿是一种植物肿瘤，是一堆未分化的组织团。形成了冠瘿瘤的植物，由于水分运输和营养运输受到干扰，往往会导致生长减缓，甚至出现病态。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒，简称Ti质粒。一、Ti质粒的结构T质粒为环状双链DNA，相对分子质量为1.2×108，片段大小为200~250kb。Ti质粒可分为4个区：①T-DNA区(transfer-DNAregion)，Ti质粒中能转移到植物细胞内的区域，称为T-DNA(transferDNA)，是Ti质粒最重要的组成部分。不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24kb之间。T-DNA区所携带的基因主要有两个功能，一是决定肿瘤的形成和形态，二是控制冠瘿碱的合成。一、Ti质粒的结构②毒性区(virulenceregion，vir)，位于T-DNA区的上游的一个30~40kb的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但其表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移，这一区域也称为致病区。③接合转移区(regionencodingconjucations，con)，该区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因(tna)，这些基因受宿主细胞合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌之间转移。一、Ti质粒的结构④复制起始区(originofreplication，ori)，调控质粒的自我复制。二、Ti质粒的改造①保留T-DNA的转移功能；②取消T-DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可再生植株；③通过简便的手段可使外源DNA插入T-DNA，并随着T-DNA整合到植物染色体上。三、Ti质粒表达载体1.一元载体一元载体就是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。由于该载体的T-DNA区与Vir区紧密连锁，也称为顺式载体（cis-vector）。三、Ti质粒表达载体2.双元载体双元表达载体由2个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成：（1）微型Ti质粒（min-Tiplasmid），是含有T-DNA边界，缺失Vir基因的Ti质粒，同时还带有目的基因，选择标记基因和多克隆位点以及大肠杆菌和农杆菌的复制起始位点。该质粒也称大肠杆菌一农杆菌穿梭质粒，但载体上不带Vir。（2）辅助Ti质粒（helperTiplasmid），含有T-DNA所必须的Vir区段，它缺失或部分缺失T-DNA序列，其主要功能是表达毒蛋白，激活T-DNA转移。三、Ti质粒表达载体（3）利用二元载体进行遗传转化时，首先要将外源基因构建到微型Ti质粒上，再将微型Ti质粒转入含有辅助Ti质粒的土壤农癌杆菌菌株中，用该菌株侵染植物组织，含目的基因的T-DNA可整合到植物基因组中。双元载体不仅构建方便，而且其T-DNA整合进入植物细胞不需要带进许多冗余DNA序列，转化效率高于一元载体。第五节病毒表达载体一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体1.杆状病毒的生物学特性杆状病毒的主要代表为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornianuclearpolyhedrosisvirus，AcNPV）和家蚕核型多角体病毒（Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV）。杆状病毒颗粒呈杆状，其基因组为一双链闭合环状DNA，长度是80～220kb。一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体1.杆状病毒的生物学特性杆状病毒的主要代表为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornianuclearpolyhedrosisvirus，AcNPV）和家蚕核型多角体病毒（Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV）。杆状病毒颗粒呈杆状，其基因组为一双链闭合环状DNA，长度是80～220kb。每种杆状病毒的宿主范围很窄，专一性感染无脊椎动物，对脊椎动物和植物细胞无感染性。一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体利用AcNPV为载体表达外源基因时，外源基因通常在一个强的多角体蛋白启动子的控制下。具有感染性的病毒颗粒通过吞饮或融合作用进入易感昆虫细胞内，6h后病毒DNA开始复制，以后不论在昆虫细胞内还是昆虫幼体内都分为两个周期，第一周期表现为早期被感染细胞通过芽生方式释放胞外病毒颗粒（ECV）；第二周期表现为感染后期，细胞核内形成包含体病毒颗粒（多角体病毒颗粒，OV）。昆虫细胞在感染后期被溶解后，OV颗粒从胞内释放出来。多角体蛋白是包含体的主要成份，约29kD，感染后期多角体蛋白累计达到很高的水平，每1×106～2×106感染细胞可达1mg，达昆虫细胞蛋白的30%～50%。一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体多角体蛋白并非病毒生命必需成分，但可保护病毒免受环境因素的灭活作用。病毒体内的另种高表达蛋白为P10蛋白，在细胞核内和浆内形成纤维网状，可能与细胞的溶解有关。P10蛋白基因和多角体蛋白基因都已被定位、克隆和测序，其启动子具有极强的启动蛋白表达能力，被用来构建杆状病毒转染质粒。一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体2.杆状病毒表达载体的构建其载体的构建策略是：在基础质粒（如pUC质粒）上插入多角体蛋白基因（或P10蛋白基因）及其两端侧翼，并在多角体蛋白基因启动子（或P10启动子）下游编码区产生缺失，去除编码序列，然后在此部位插入多克隆位点（MCS）用于外源基因的克隆，外源基因插入后形成重组杆状病毒克隆载体。然后再与野生型AcNPVDNA混合共转染昆虫细胞，外源基因整合到病毒基因组的相应位置。筛选。以纯化的重组病毒感染宿主细胞或幼虫，可获得大量的外源基因表达产物。一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体3.杆状病毒转移载体的构成元件不同的杆状病毒表达系统的转移载体各不相同，但一般带有以下基本元件：（1）启动子。不同的转移载体具有不同的启动子，有的载体可能有多个启动子以利于同时表达多个外源基因。杆状病毒的启动子包括4类：①即刻早期启动子，与病毒转录有关；②早期启动子，与病毒复制有关；③晚期启动子，控制病毒的组装；④非常晚期启动子，控制包含体的形成或细胞溶解。（2）polyA加尾信号。转移载体上的polyA加尾信号有的采用杆状病毒多角体蛋白基因自身序列，有的采用SV40的相关序列。（3）同源重组序列。多角体蛋白基因序列是早期表达系统常用的同源重组序列，由于多角体蛋白基因的缺失形成不同的空斑形态，可借此筛选重组病毒；也有使用P10蛋白基因序列作为重组序列使用，但是还必须对载体进行其它加工，以方便对重组病毒的筛选。（4）穿梭载体必需元件。多数转移载体为穿梭质粒载体，除带有病毒自身的复制起始位点外，还带有pUC质粒的复制子及Ampr，可以在细菌内进行扩增。（5）筛选标记。早期的表达系统一般根据空斑形态筛选重组病毒，新近开发的表达系统的转移载体将lacZ基因置于启动子的下游，可以根据空斑的颜色筛选重组病毒。一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体4.杆状病毒表达载体的特点在昆虫细胞表达蛋白质的杆状病毒载体是一种较为理想的真核基因工程载体，应用广泛。此类载体具有以下优点：①杆状病毒表达体系全部使用存在于高等真核细胞内的蛋白质修饰、加工和转运体系；②AcNPV是非辅助病毒，不需要任何辅助因素，可在悬浮培养的昆虫细胞内大量增殖，易获得大量的重组蛋白；③大部分表达的蛋白质在昆虫细胞中能保持活性和可溶性，优于细菌；一、昆虫细胞的杆状病毒表达载体④杆状病毒的基因组较大（128kb），适合克隆大片段外源基因；⑤杆状病毒宿主范围很窄，不感染脊椎动物，其启动子在哺乳动物细胞中无活性，用它表达癌基因或毒性蛋白较安全。但是用杆状表达载体的潜在缺点是最初的分离和起始的病毒重组体的构建是不容易的。二、SV40病毒表达载体当表达高等真核基因时，哺乳动物表达体系比昆虫表达体系显得更为优越。当前较广泛的应用哺乳动物表达体系的载体有猿猴空泡病毒40（simianvacuolationvirus40，SV40），牛乳头状瘤病毒（papillomavirus）和非洲淋巴瘤病毒（EpsteinBarrvirus，EB病毒）。在众多的病毒载体中，SV40表达载体是研究得最为详细、发展最快的一种。二、SV40病毒表达载体1.SV40病毒载体生物学特征SV40病毒是一种小型二十面体的蛋白质颗粒，由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成，中间包装着病毒基因组DNA。SV40DNA是双链闭合环状DNA分子，长度5243bp。二、SV40病毒表达载体1.SV40病毒的基因特征野生型的SV40病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小的重组DNA就不能被包装为成熟的病毒颗粒，野生型SV40DNA需去除部分非必需序列才可用为载体。用SV40作为载体有两种方式：①用SV40DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒；②重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。三、反转录病毒载体1.反转录病毒的生物学特征反转录病毒(Retroviruses)是一类含单链RNA动物病毒，又称逆转录病毒，此类病毒能够感染多种脊椎动物和无脊椎动物。反转录病毒至少含下列三种基因：①gag，组成病毒中心和结构的蛋白质的基因，②pol，逆转录酶基因，③env，包含组成病毒外壳的基因。此外，在其病毒颗粒内部还包含有tRNA引物分子、RNaseH和整合酶基因等组分。①在大多数情况下,反转录病毒的肿瘤基因(oncogene,ONC)都能够在细胞中转录。这种特性说明反转录病毒有可能是一种天然的转录因子,借此可将其改建成为动物基因转移载体;②反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物；③反转录病毒不但感染效率高,而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代,保持正常生长和保持病毒感染性的能力。因此，可以利用反转录病毒作载体来改变动物细胞的基因型，并顺利地将目的基因遗传到子代细胞。目前研究得最详尽的是劳斯肉瘤病毒(Rous’sarcomavirus,RSV)。反转录病毒特点：三、反转录病毒载体2.劳斯肉瘤病毒(Rous'sarcomavirus,RSV)载体原病毒DNA的结构特点

一般反转录病毒的原病毒DNA都是由两个主要部分组成的，即长度达数千碱基对的中间区，及其两侧的长末端重复序列(longterminalrepeats，LTR)。这两段5'-LTR和3'-LTR各长数百个碱基对，呈同向排列，它是由病毒RNA分子5'-末端的r-u5序列和3'-末端的u3-r序列结合而成的。

MLV原病毒DNA基因组结构反转录病毒的基因转录和翻译过程三、反转录病毒载体3.RSV病毒载体的构建3.RSV病毒载体的构建3.1反转录病毒载体的构建原理反转录病毒载体系统共由两部分组成:包装细胞系和缺陷病毒本身。在反转录病毒载体中,去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号,通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上,而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后,缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞,此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中,导致插入序列在宿主细胞中表达,从而产生目的蛋白。

承载数个外源基因，插入片段可达6-20kb。3.RSV病毒载体的构建3.2反转录病毒载体的主要类型辅助病毒互补反转录病毒-质粒载体，在大肠杆菌细胞中增殖，经过改造的原病毒DNA克隆到大肠杆菌质载体上，成为反转录病毒-质粒载体；不需要辅助病毒互补反转录病毒-质粒载体，在包装细胞中能够组成表达反转录病毒的全部蛋白质，但由于gag在它们合成的mRNA分子中缺失了psi序列，故只能形成中空的病毒外壳(假病毒)，这种假病毒感染敏感细胞后，由于重组反转录病毒基因组的部分缺失，不会产生具有感染性的病毒颗粒，避免了病毒的副作用。重组反转录病毒的质粒载体结构3.RSV病毒载体的构建3.3反转录病毒载体的特点在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因（oncogene，onc）都能够在细胞中转录。这种特性说明反转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，我们可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因的转移载体；反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物。其中有的还能够在人体细胞中生长；反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。因此有可能利用反转录病毒作载体，改变动物细胞的基因型，并可遗传到子代细胞。四、腺病毒克隆载体1.腺病毒的一般生物学特征腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳是由252个壳粒构成的、呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。腺相关病毒基因过表达载体四、腺病毒克隆载体4.腺病毒载体的优点（1）宿主范围广,对人致病性低。（2）在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因。（3）能有效进行增殖，滴度高。（4）与人类基因同源。（5）不整合到染色体中，无插入致突变性。（6）能在悬浮培养液中扩增。（7）能同时表达多个基因。第六节人工染色体载体

人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千