第一章 基因工程绪论

基因工程第一章绪论一、为什么学习基因工程？（人类面临的问题）二、基因工程的四大里程碑三、基因工程的三大技术发明四、基因工程的研究内容《荷塘月色》基因工程技术版紫外光如流水一般，静静地泻在这一块琼脂糖凝胶和PE手套上，细细的亮亮的PCR产物条带呈现在眼前，仿佛在Running缓冲液中洗过一样。虽然是白天，但是因为有一只暗箱，所以没有朗照，紫外光是隔着石英玻璃照过来的，除了引物DNA在溴酚蓝前有微弱的亮带外，红红PCR产物如少女亭亭玉立般等着你的赏析、拍照。

基因之《大话西游版》曾经有一段真诚的目的基因放在我质粒的面前，我没有珍惜,等到失去的时候才追悔莫及。基因工程中最痛苦的事情莫过于此。如果实验员能够给我一个重新来过的机会，我会对那段基因说三个字，克隆吧。如果非要给这份技术加上一个方法，我希望是，PCR。基因工程与梦想西方传说中的美人鱼人类对新生物的构想意大利人的头发埃及人的眼睛希腊人的鼻子美国人的牙齿泰国人的脖子澳洲人的胸部瑞士人的手斯堪的纳维亚人的腿中国人的脚奥地利人的声音日本人的笑容英国人的皮肤法国人的曲线西班牙人的步态克莉丝汀-戴维斯梦想中完美女性一、为什么学习基因工程？（人类面临的问题）人口问题人类面临重大问题与我们息息相关人口问题人口问题粮食问题人类面临重大问题与我们息息相关为什么要学习生命科学？人口问题粮食问题健康问题人类面临重大问题与我们息息相关为什么要学习生命科学？健康问题《2019国民健康洞察报告》《报告》从国民的健康现状、健康素养、健康生活诉求、医疗服务诉求、健康消费诉求五个角度分析。人口问题粮食问题健康问题为什么要学习生命科学？环境问题人类面临重大问题与我们息息相关解决之道？基因工程技术人口粮食环境医疗资源…二、基因工程的四大里程碑四大里程碑遗传物质的明确——DNADNA双螺旋结构理论（半保留复制及其中心法则）基因遗传密码子的破译基因转移载体的发现里程碑之一

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遗传物质的发现基因的化学本质经典试验---肺炎链球菌的转化试验（1928年）（I）FrederickGriffith(1879–1941)肺炎链球菌是一类能够引起肺炎等疾病的革兰氏阳性菌。它存在两种类型：R型：rough，菌体无荚膜，菌落粗糙，无致病性，不致死。S型：smooth，菌体具有荚膜，菌落光滑，致病性强，致死。基因的化学本质经典试验---肺炎链球菌的转化试验（1928年）（I）FrederickGriffith(1879–1941)实验证明，在S型中有一种“转化因子”(transformingprinciple)促成了R型的转化。R型S型？1944年，Avery精确重复转化实验，确定了转化因子。经典试验---肺炎链球菌的转化试验（II）OswaldAvery（1877-1955）RockefellerInstituteforMedicalResearch（I）加S型菌的DNA长出S型菌1944年，Avery精确重复转化实验，确定了转化因子。经典试验---肺炎链球菌的转化试验（II）（1）从活的S型菌中抽提各种细胞成分（DNA，RNA，蛋白质，荚膜多糖等）（2）对各种生化组分进行转化试验活R型菌（II）加S型菌的DNA和DNA酶以外的酶（III）加S型菌的DNA和DNA酶只长R型菌（IV）加S型菌的RNA（V）加S型菌的蛋白质（VI）加S型菌的荚膜多糖实验证明，S型菌转移给R型菌的转化因子是DNA。噬菌体的遗传物质是DNA的实验里程碑之二---DNA双螺旋结构理论里程碑之二---DNA双螺旋结构理论40年代末，英国科学家莫里斯·威尔金斯等用X射线衍射技术对DNA结构潜心研究了3年，意识到DNA是一种螺旋结构。1951年底，女物理学家罗莎琳德·富兰克林拍到了一张十分清晰的DNA的X射线衍射照片。照片51号里程碑之二---DNA双螺旋结构理论威尔金斯出示了富兰克林在一年前拍下的DNAX射线衍射照片，沃森看出了DNA的内部是一种螺旋形的结构，他立即产生了一种新概念：DNA不是三链结构而应该是双链结构。照片51号1953年，J.Watson和F.Crike创立DNA双螺旋模型，证实基因是具有一定遗传效应的DNA片段。里程碑之二---DNA双螺旋结构理论1958年，富兰克林因支气管肺炎及卵巢癌逝世于英国伦敦。1963年，沃森、克里克和威尔金斯荣获诺贝尔生物学或医学奖。被遗忘的英格兰玫瑰：罗莎琳德·富兰克林（RosalindFranklin）（1920年7月25日-1958年4月16日）DNA二级结构的多态性A型，右手螺旋，外形粗短，常见的是dsRNA，A-DNA，DNA-RNA；B型，典型的

Watson-Crick双螺旋DNA，是生理条件下有机序列，DNA分子中最稳定的结构，也是研究的参照标准点；Z型，左手螺旋，外形细长，可以与B型DNA之间互相转换。里程碑之三---遗传密码的发现遗传密码是通用的，将DNA或RNA序列以三个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列，以用于蛋白质合成，在所有生物中都是相同的。里程碑之三---遗传密码的发现遗传密码是通用的，将DNA或RNA序列以三个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列，以用于蛋白质合成，在所有生物中都是相同的。

1961年，美国国家卫生院的海因里希·马太与马歇尔·沃伦·尼伦伯格在无细胞系统环境下，把一条只由尿嘧啶（U)组成的RNA翻译成一条只有苯丙氨酸（Phe）的多肽，由此破解了首个密码子（UUU->Phe）。里程碑之三---遗传密码的发现遗传密码是通用的，将DNA或RNA序列以三个核苷酸为一组的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列，以用于蛋白质合成，在所有生物中都是相同的。

1961年，美国国家卫生院的海因里希·马太与马歇尔·沃伦·尼伦伯格在无细胞系统环境下，把一条只由尿嘧啶（U)组成的RNA转释成一条只有苯丙氨酸（Phe）的多肽，由此破解了首个密码子（UUU->Phe）。随后科拉纳（HarGobindKhorana）破解了其它密码子，接着霍利（RobettW.Holley）发现了负责转录过程的tRNA。里程碑之三---遗传密码的发现1968年，科拉纳、霍利和尼伦伯格分享了诺贝尔生理学或医学奖。里程碑之三---遗传密码的发现霍利（1922-1993），科拉纳（1922-2011），尼伦伯格（1927-2010）里程碑之四---基因转运载体的发现Fig.4.-ElectronmicrographstakenofColE1DNApurifiedbyMAKcolumnchromatography.(a)OpenandsupercoiledcircularDNAofthe2.3-jclass.X49,000.(b)Anopen2.3-ucircularmoleculejuxtaposedtoitssupercoiledallomorph.X56,000.(c)Supercoiledforms(2.3uand4.7u).X56,000.(d)Opencircularforms(2.3pand4.7IA).X56,000'(e)SupercoiledcircularformofColElDNA,4.7-tt,extractedbytheMarmurproceduresSuper-coiledformsthusextractedappearedmoretightlytwisted.X56,000.1967年，罗思和海林斯基发现细菌染色体DNA之外的质粒有自我复制的能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到一种运载工具。Roth

TF,

Helinski

DR.PNAS.

1967;58(2):650–657里程碑之四---基因转运载体的发现（1）FIG.1.GeneralprotocolforproducingcovalentlyclosedSV40dimercirclesfromSV40(I)DNA.1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与大肠杆菌的DNA片断连接起来。标志着基因工程技术的诞生Jackson,D.A.,Symons,R.H.andBerg,P.PNAS。1972。69:2904-2909里程碑之四---基因转运载体的发现（2）1980NobelPrizeinChemistryBoyer-Cohen实验1973年斯坦福大学的S.

Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌pSC101质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC102连接成重组质粒，具有双重抗药性。StanleyN.Cohen,AnnieC.Y.Chang,HerbertW.Boyer,andRobertB.Helling.PNAS。197370(11)3240-3244里程碑之四---基因转运载体的发现（3）KanamycinandTetracyclinresistantE.coliTetracyclinresistantgeneKanamycinresistantgeneEcoRIEcoRI三、基因工程的三大技术发明三大技术发明工具酶的发明：内切酶、合成酶、连接酶PCR技术（PCR扩增仪）基因合成和测序（合成仪、测序仪）技术发现之一---工具酶技术发现之一---工具酶（1）人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍，即所谓寄主控制的限制与修饰现象的简称（Restriction/Modification,R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。大多数限制性内切酶常常伴随有1~2种修饰酶（DNA甲基化酶），后者能保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。技术发现之一---工具酶（2）1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coli

B和E.coli

K中分离出的核酸内切酶EcoB和EcoK，是I型的，没有实用价值。技术发现之一---工具酶（3）1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出的限制酶HindII，是特异性切割的II型。工具酶种类核糖核酸酶（Rnase）

脱氧核糖核酸酶（Dnase）DNA连接酶、RNA连接酶(ligase)

DNA聚合酶（DNApolymerase）

RNA聚合酶（RNApolymerase）

反转录酶（reversetranscriptase）

限制性核酸内切酶（restrictionendonucease）技术发现之二---PCR技术

（PCR扩增仪）在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的PCR技术。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。技术发现之二---PCR技术（PCR扩增仪）技术发现之二---PCR技术（PCR扩增仪）技术发现之二---PCR技术（PCR扩增仪）技术发现之二---PCR技术（PCR扩增仪）技术发现之二---PCR技术（DNA聚合酶）技术发现之三---基因合成仪和测序仪DNA测序技术（1）第一代测序，Sanger法（链终止法）、化学降解法，凝胶电泳；技术发现之三---基因合成仪和测序仪（1）DNA测序技术（1）第一代测序，Sanger法（链终止法）、化学降解法，凝胶电泳；（2）第二代测序，Roche公司的454技术（焦磷酸测序）、ABI公司的SOLiD技术和Illumina公司的Solexa技术，高通量测序技术；技术发现之三---基因合成仪和测序仪（1）DNA测序技术（1）第一代测序，Sanger法（链终止法）、化学降解法，凝胶电泳；（2）第二代测序，Roche公司的454技术（焦磷酸测序）、ABI公司的SOLiD技术和Illumina公司的Solexa技术，高通量测序技术；（3）第三代测序，PacBio的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子技术，单分子测序。技术发现之三---基因合成仪和测序仪（1）PacBio的SMRT技术DNA测序技术（1）第一代测序，Sanger法（链终止法）、化学降解法，凝胶电泳；（2）第二代测序，Roche公司的454技术（焦磷酸测序）、ABI公司的SOLiD技术和Illumina公司的Solexa技术，高通量测序技术；（3）第三代测序，PacBio的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子技术，单分子测序。技术发现之三---基因合成仪和测序仪（1）DNA合成技术，按照预定核苷酸的顺序，将脱氧核苷酸逐个进行人工连接合成DNA链的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚体支持物上从3′端延伸核苷酸，可自动化操作。技术发现之三---基因合成仪和测序仪（2）以上研究成果综合，催生了基因工程

自基因工程问世以的三十几年，是基因工程迅速发展的阶段。如果说20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，那么二十一世纪初将是基因工程应用研究的鼎盛时期。基因工程的迅速发展阶段二、基因克隆的概念与基本步骤1．基因克隆的概念1972年，以P.Berg等人为代表的一批科学家发展了有关重组DNA的技术；1973年，H.Boyer和Cohen完成了第一个基因的克隆，由此宣告了基因克隆技术的诞生。“克隆”（clone）一词作名词使用时是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的群体；作动词使用时，是指产生这一群体的过程。基因克隆是指在体外，借助于能自我复制的载体分子，将目的基因引入到宿主细胞中进行增殖，以获得大量纯一的特定DNA片段的过程。同义词包括：重组DNA，分子克隆，遗传工程,基因工程等A重组DNA技术的基本定义

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。B基因工程的基本定义

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。C重组DNA技术与基因工程的基本用途

分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程天然细胞天然细胞生物活性物质生物活性物质D基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程第五代基因工程基因编辑基因组工程四、基因工程的研究内容（1）基因工程载体的研究

原核载体和真核载体；克隆载体和表达载体；质粒载体、噬菌体载体、病毒载体及其他载体等。基因工程载体的研究是基因工程研究的重要内容之一。1．基因克隆工具的研究（2）工具酶的研究主要包括：限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶各种修饰酶

1．基因克隆工具的研究（3）基因工程受体系统的研究受体是载体的宿主，是外源基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体。目前最常用的受体系统是大肠杆菌受体系统和酵母受体系统。其他受体系统：链霉菌、芽孢杆菌、丝状真菌及动物细胞。利用动物的组织（如：乳腺组织、胚胎组织等）作为受体进行基因表达的研究等1．基因克隆工具的研究以PCR为基础的差异筛选技术长片段的DNA序列测定技术高通量的基因芯片技术高通量测序技术借助计算机和互联网的生物信息技术，等等……2．基因克隆技术的研究基因是一种有限的重要战略性资源人类基因组计划中科学家们的最新研究结果，人类基因总数比预期的低得多，初步定位在3.0万个左右，如此少的基因自然成为激烈竞争的对象。3．克隆对象——目的基因的研究我国科学家完成的水稻基因组测序研究成果发表在国际权威的SCIENCE杂志2014年全球转基因作物在各国的种植面积（百万公顷）

基因工程药物——高新技术产业——新的药业革命1982年美国Lily公司首先将重组胰岛素投