2型糖尿病易感基因研究进展

2型糖尿病易感基因研究进展2型糖尿病（T2DM）是遗传和环境因素共同作用导致的复杂疾病。T2DM的家族聚集性、同卵双生子发病的高一致性以及在某些种族人群中的高发率均强烈提示遗传因素在其发病中的作用。相关研究预计有30%～70%的T2DM患者患病风险可归因于遗传易感性。同时，T2DM具有遗传异质性，其表型受到多基因遗传背景和复杂环境因素的共同控制。具体说来，每个患者可能有不同的易感基因组合，而非患者人群亦可不同程度集结各种遗传和环境疾病易感因素；就单个遗传或环境因素而言，易感基因在患者群与非患者群中均可存在，其差别仅是频率上的差异。因此，确认T2DM易感基因实非易事。迄今为止，T2DM易感基因究竟有多少以及其相互作用尚未完全明确，但2007年以来T2DM相关全基因组关联研究（Genome-WideAssociationStudies，GWAS）取得的丰硕成果仍然令人鼓舞。本文将就寻找T2DM易感基因的策略和成果、国内相关研究现状以及进行此类研究的意义进行综述。一、T2DM易感基因定位策略的发展过程随着基因分型技术的进步和遗传学统计分析专业的发展，T2DM易感基因定位策略也在不断地发展变化。目前为止，T2DM易感基因定位策略的发展过程可大体分为两个阶段：2006年以前的“前GWAS阶段”和其后的“以单核苷酸多态性（SNPs）为遗传标记的GWAS”阶段。1.前GWAS阶段：2006年以前的基因组研究以限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）和微卫星标记（又称简单重复序列，simplesequencerepeats，SSR）为遗传标记，这些遗传标记密度低、覆盖性差，加之高通量的基因分型检测技术尚未出现，使得T2DM的遗传学研究进展相对缓慢。该阶段主要应用的T2DM易感基因定位策略有以下几种：（1）基于家系的基因组扫描和连锁分析的定位克隆研究策略。基本原理：以限制性片段长度多态性或微卫星为遗传标记，通过遗传连锁分析，将T2DM易感基因定位在特定的染色体区域，然后再通过不断缩小定位区域并最终克隆该基因，进一步阐明该基因的功能。成果：这种研究策略的成功主要在于发现了几种符合孟德尔遗传模式的特殊单基因形式糖尿病的致病基因如青少年发病的成年型糖尿病（MODY）基因、新生儿糖尿病致病基因（表型不同，致病基因也不同，已发现的有KCNJ11、ABCC8、EIF2AK3等等）和某些胰岛素抵抗相关综合征的致病基因（如Wolfram综合征的致病基因WFS1）等。这些相对少见糖尿病的致病基因的发现，为更多了解参与糖调节的生物学通路打开了新的视野，从而也间接为T2DM候选基因的选择提供了位置和功能上的参考。另外从治疗角度来讲，明确这些特殊类型糖尿病的致病基因也有利于选择相应的治疗方案。比如，我们已知磺脲类药物作用的靶点KCNJ11，而新生儿糖尿病致病基因是KCNJ11的发现使我们明确了治疗这种糖尿病的最好方法就是应用磺脲类药物而不再需要胰岛素治疗。不足：受遗传学标志的覆盖率及分型技术等的限制，加之连锁分析与复杂疾病的符合度较低等原因，鉴定易感基因时易出现信号不强、遗漏多和重复性差等缺陷，因此，该研究策略对识别多基因遗传背景的T2DM易感基因收效甚微。糖尿病/（2）基于病例对照研究的候选基因研究策略。基本原理：通过选择与血糖稳态、脂代谢及信号传导等有关的基因作为候选基因，通过比较各个基因的多态性在患者与正常对照中的差别是否有显着性，来筛查可能的易感基因。成果：同样不理想。曾对数百个候选基因进行了研究，2006年以前，虽然在不同人群中有多个易感基因被发现（如ENPP1、IRS1、IRS2、PPAR-γ、KCNJ11），但只有PPAR-γE23和KCNJ11这雨个基因在多个病例一对照研究中得到了一致的结果。另外，2007年，Sandhu等应用候选基因策略在英国人群和德系犹太人发现了WFS1与T2DM的相关性，并以大样本荟萃分析进一步证实了这种相关性。不足：该策略只能发现和验证已知功能的候选基因在T2DM中的作用，而不能带领我们了解和发现新的未知的疾病相关代谢通路。由于我们对与血糖稳态相关的许多代谢通路还不清楚，导致候选基因的选择本身就很局限，加之早期病例对照研究样本量小，无法克服这类研究设计的固有缺陷（如更易受人群分层、遗传异质性和对轻中度作用基因的研究把握度低等因素）影响，研究结果重复性差。（3）候选基因定位克隆策略。基本原理：该策略是定位克隆法和候选基因法的结合，是对定位克隆的改进。该方法首先将T2DM易感基因定位到某一染色体区域，然后再找出区域内的所有基因，根据这些基因的生化特性、表达时空特异性、功能结构域等筛选与疾病相关的候选基因，以病例对照研究确定致病基因。成果：Grant等应用这种策略发现冰岛人群TCF7L2多态性与T2DM显着相关。不足：在该策略中，锁定连锁区只是易感基因定位的第一步，由于连锁区往往已经分布成百上千个基因，常常会在锁定了一个可疑区域以后候选基因筛查却无功而返，使得该定位策略相当被动。（4）通过表达水平的改变发现易感基因（表型克隆策略）。基本原理：生物体内任意细胞中得以表达的基因不足10%，而这些基因的表达是按时间和空间顺序有序进行的，此即为基因的差异表达。在真核生物中，从个体的生命活动、组织的分化、凋亡到细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。表型克隆策略的特点是既不考虑基因的功能线索，也不考虑基因在染色体上的位置信息，而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上的差异，联系疾病的表型与基因，故又称为表型克隆。表型克隆研究有差异显示PCR、抑制性消减杂交和基因鉴定集成法等多种技术方法。研究者可以依据自身研究条件，选择适合的方法。成果：通过这种研究策略，Patti等于2003年发现PGC-1α和PGC-1β促进脂肪酸β氧化、肌肉中葡萄糖的转运和肝糖异生，与T2DM显着相关；2005年，Gunton等发现ARNT/Hif1β与T2DM显着相关。不足：各种鉴定技术各具特点也各有不足，比如假阳性率高和操作自动化程度低等等，需要结合自身情况选择适合方法。总体来说，在这个阶段，除了在一些特殊单基因糖尿病的致病基因研究方面有了不错的成绩，T2DM易感基因的研究可谓事倍功半，似乎陷入了瓶颈。2.GWAS阶段：GWAS是指在全基因组层面上，开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，全面揭示疾病发生、发展与治疗相关的遗传基因。简言之，就是从人类全基因组范围内的序列变异-单核苷酸多态中，筛选出那些与疾病性状关联的SNPs。近几年来，几种关键技术的进展使我们能够将关联研究从候选基因扩展到全基因组。首先，数百万个SNP公共数据库的建立是基础；这些常见变异解释了绝大多数人类个体间的差异，它们在疾病发生中的作用也将逐渐被揭示。其次，“国际HapMap计划”对270个DNA样本中380万个SNP基因型的测定及对单倍tagged-SNP的鉴定，可用于指导所谓tagged-SNP的选择，从而加快发现大多数余下的常见基因变异。此外，高通量基因型检测技术的建立和随之开发的遗传学统计分析方法使得大规模高通量的T2DM易感基因病例对照研究成为现实。目前为止，公认的T2DM易感基因已经增至20个，同时还发现了13个影响空腹血糖的基因以及5个影响餐后血糖的基因。可以说GWAS使糖尿病的病因学研究突破瓶颈，迎来了新的曙光。（1）GWAS的基本原理和研究设计类型：GWAS的设计基本原理与经典的病例对照研究相同，即假设某个SNP与疾病发生关联，则理论上病例组中该SNP的等位基因频率应当高于对照组（未患有该疾病）。然后通过假设检验来检验该假设。考虑到研究的成本、基因分型的成本以及研究的把握度等方面的因素，GWAS的研究设计目前分为单阶段研究、两阶段研究或多阶段研究设计。单阶段研究因基因分型耗资，为节约基因分型的数量和成本，两阶段研究正在被更多研究者所采用。多阶段研究基本思路与两阶段研究类似，不过在进人大样本验证之前，用更多步骤、更加细化了第一阶段SNP筛选的过程；（2）GWAS在寻找T2DM易感基因方面的成果：T2DM相关GWAS研究不仅验证了前期一些已知基因位点的作用，还发现了多个新的T2DM相关基因。这些研究使我们得以从更多角度理解了遗传因素在T2DM发生发展中所起的作用。GWAS成果：如前所述，2006年以前，通过“候选基因”筛查出的T2DM基因有PPAR-γ和KCNJ11；2006年，经部分精细制谱定位出TCF7L2；2007年Sandhu又通过候选基因策略发现WFS1。2007年，Sladek以GWAS定位发现TCF7L2、HHEX、SLC30A8与T2DM相关。以上6个基因与T2DM的相关性均在后来的GWAS中得到验证。2007年，WTCCC、DGI、FUSHION3个国际知名研究组发表了其GWAS的成果——T2DM的6个新的易感基因：FTO、HHEX、CDKAL1、IGF2BP2、CDKN2A、SLC30A8。在此基础上，WTCCC研究者综合3个研究组的数据，再次确认了6个新的T2DM基因：JAZF1、CDC123-CAMK1D、TSPAN8-LGR5、THADA、ADAMTS9、ADAM30/NOTCH2。2008年，Yasuda等在日本人群中发现了KCNQ1与T2DM的相关性，并将该结果在韩国、中国、欧洲人群中进行了验证。2009年，Miyake等又公布了基于11个T2DM强关联易感基因而建立的日本人群T2DM风险预测模型。同年，Bouatia-Naji等先后于法国、欧洲人群中发现了MTNRIB基因与空腹血糖升高及T2DM的相关性。2010年6月，对欧洲人群的GWAS及荟萃分析显示，染色体2q24上的易感位点SNPrs7593730可能因影响糖代谢及胰岛素抵抗而与T2DM风险相关。2010年9月，Vanderbilt大学研究人员又公布了3个分别位于染色体13q31.1、10p13和15q22.2上的T2DM风险位点。至此，T2DM的易感基因已定位多达20余个。另外值得注意的是，空腹及餐后血糖是糖尿病的重要性状，近来有研究发现，影响这些性状的基因与糖尿病的易感基因有很多重叠，如TCF7L2、SLC30A8、MTNR1B、GCKR等。T2DM相关GWAS研究的成果带来的启示：①人们注意到在这些新被定位的T2DM易感基因绝大多数与胰岛β细胞的发育或功能密切相关，只有IGF2BP2、PPAR-γ和FTO被发现与胰岛素抵抗相关。然而这未必说明在T2DM发病机制当中，β细胞功能缺陷起着比胰岛素抵抗更重要的作用。一般在GWAS中选择的病例人群往往集中于已有明显血糖升高的糖尿病患者，这部分人都已有明显的β细胞功能缺陷，研究结果同样倾向于发现影响β细胞发育或功能的基因。若想发现通过胰岛素抵抗机制引起T2DM的易感基因可能需要有另外一种实验设计，比如选择糖尿病前期人群作为研究人群。另外，相比胰岛素分泌的遗传控制的更纯粹性，胰岛素抵抗与体重、运动等因素之间的强烈的遗传一环境相互作用也会给GWAS发现潜在的胰岛素抵抗相关基因带来障碍。②这些易感基因的频率普遍较高（从TCF7L2的0.26到PPAR-γ/的0.85），而作用甚微。实际上，已知有99%的人携带9个或更多的易感基因，但只有80/0～10%患糖尿病。或许这些易感基因的“微效”可以用这样一个现象解释——易感基因上的风险变异大多位于非编码区，因此它们可能是通过调节基因表达来发挥作用，这与MODY基因变异直接导致氨基酸替代和蛋白质变化的作用方式截然不同。③目前已确认的位点只能解释T2DM家族聚集现象的一小部分。在WTCCC研究中，9个作用最强的位点全部加起来才能解释T2DM先证者同胞较正常对照增加的30%～60%的患病风险中的7%。我们的GWAS基于的一个假设是：T2DM的遗传倾向是由多个小到中效的常见变异的集合所决定的，如果这个假设没有错，那就意味着我们目前所发现的易感基因还只是冰山一角，仍有大量“微效”易感基因有待进一步研究发现。④基于多个研究组数据的荟萃分析，对易感基因的发现贡献颇多，是解决样本量“永远不够大”的有效手段。另外，充分利用现有的公共数据库，利用数据挖掘技术寻找易感基因也是一个可行的途径。最近美国一项研究利用这种策略发现碳水化合物代谢通路中某些关键基因上的SNP与T2DM相关数量性状相联系；（3）GWAS研究的局限性及未来的研究趋势：在取得丰硕成果的同时，也不应忽视的一个事实是，GWAS研究无论是从研究设计上还是在统计分析上都还存在诸多局限性：①如前所述，目前的GWAS研究方法是基于“常见疾病-常见变异”的假设，即假设携带T2DM风险的遗传变异都是人群中频率≥5%的常见变异。但事实上，我们并不能否认另一种假设的可能：T2DM的遗传易感性也有可能是若干具有较大效应的少见变异决定的。况且，目前发现的风险变异只是用于推定病因变异的路标，并不一定就是真正的病因性变异。因此，想要寻找少见变异或病因变异，还需要在更大样本的糖尿病和对照人群中进行精细制谱（finemapping）和再测序（resequencing）。②对于GWAS研究策略的研究设计上存在的局限性：GWAS研究中，疾病的状态有时很难测量、或者模糊不清难以判断。比如T2DM是一种年龄相关的疾病，因而事实上任何对照人群都会包括一些具有T2DM易感性以后会发生糖尿病的人。从另一个角度来说，T2DM与许多代谢表型相联系，呈一个从胰岛素抵抗和β细胞功能减退开始发展为临床高血糖的进展性过程。由于这个过程中并没有精确的遗传学角度的标准来确定其中的每个阶段，GWAS研究不得不依靠T2DM、空腹血糖受损（IFG）等临床诊断标准来选择病例组，这增加了结果解释的复杂性。基于以上原因，研究T2DM相关GWAs研究中，数量表型的研究非常重要，有时甚至优于研究疾病状态。选择测量简单、准确和遗传度高的数量表型，同时，应尽可能选择那些反映疾病危险的数量表型（比如BMI，是糖尿病和其他许多疾病的危险因素）、有助于区分疾病临床亚型的表型（如胰岛素释放和胰岛素敏感性），或者那些用来诊断疾病的表型（如空腹血糖用来诊断糖尿病）。③GWAS统计分析工作中的挑战：数据分析会涉及到数千数万次的比较，因此，多重假设检验导致的Ⅰ类错误扩大带来了假阳性问题。人群的混杂同样会带来假阳性问题。对于GWAS研究而言，无论是两阶段研究设计、还是各种遗传统计方法，都无法彻底解决多重比较和人群混杂带来的假阳性。发现真正阳性位点的惟一的办法只能是重复研究。④目前的分析并未考虑把单个SNPs与其他基因或环境因素隔离出来的效应。随着这些变异的作用越来越多的被确定，应当将更多的注意集中于多个基因或基因与环境之间的相互作用。建立环境暴露技术平台，提供饮食、运动及其他环境因素相关数据的前瞻性研究将完成这一任务。近来，人们在研究遗传变异和环境因素交互作用在导致疾病发生中的作用过程中又发现了基因组拷贝数变异（copynumbervariation，CNV）在人类基因组的广泛存在，关于CNV在T2DM遗传易感性中所发挥的作用的研究已经取得初步成果。例如，Jeon等最近研究发现，LEPR基因位点上的CNV与T2DM风险相关。目前有关易感基因的研究已经开始关注基因修饰——即DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学范畴的内容，这些变化可能引起与年龄有关的基因表达的改变从而导致增龄性疾病。以上研究总体上还是属于结构基因组学的范畴。可以预见的是，由于依据遗传背景选择个体化治疗的需要，功能基因组学和药物基因组学将顺理成章地成为以后国际上T2DM遗传学研究的热点。二、国内T2DM易感基因研究现状发现，T2DM易感基因的原创性研究主要由欧美发达国家所完成，涉及种群包括欧美的白种人，非洲裔黑人和高加索人等。大约5年前，欧美发达国家抓住基因组科学的转化医学研究的契机，率先开展了复杂疾病的GWAS。2006年开始至今，大批有关T2DMGWAS工作的论文陆续发表，成果颇受瞩目。与此相比，中国T2DM易感基因研究可谓喜忧参半。1.国内T2DM易感基因研究的成绩与不足：（1）成绩：①前期对国外发现的多个易感位点开展了系列验证研究，确定其中部分基因参与了中国人T2DM的发病，比如PPAR-γ、NF-kappaB、KCNJ11、TCF7L2、IL-6-572、ADIPOQ和RETN等，同时也在中国汉族人群中发现了一些新的T2DM易感基因，诸如hOGG1、APM1、ACE、G6PC2、HNF1B以及NOS1AP等等。②GWAS最重要的前提是必须有大量的病例和对照样本以及相应的临床资料数据。以前国内复杂疾病遗传资源库和数据库建设上存在规模小、分散零乱、缺乏质控等诸多问题，近两年来，这种情况已有明显改观，国内已有多家研究单位建立了样本量达数千例甚至上万例的病例对照人群或群体样本，特别是2009年初中华医学会糖尿病学分会牵头的T2DM易感基因研究遗传资源库建设过程中，强调了深入细致的组织协调和严格的质控管理，为进一步的易感基因研究工作打下了坚实的基础。（2）不足：目前中国人群T2DM易感基因研究的原创性发现仍然较少，在大样本人群中完成的原创性发现仅有3个。其一为对影响空腹血糖的基因G6PC2开展的研究，发现它与中国人T2DM相关；其二为在染色体1q区域开展的定位克隆研究，发现了NOS1AP基因；其三为发现HNF1B为中国汉族人群T2DM易感基因。至于中国人群T2DMGWAS的原创性工作则仍是空白，考虑到在发达国家已然在T2DMGWAS方面取得的丰硕成果，这种情形不免令人担忧。2.适合于目前国情的T2DM易感基因研究策略以及应该注意的问题：由于GWAS原创性工作耗资巨大，因此目前我们国内的T2DM的遗传学研究提倡GWAS与候选基因策略并举。GWAS可以发现中国人群特有的T2DM易感基因，候选基因策略则是在中国人群中或有特定表型（如糖耐量减低、耐药性、特殊生理性质和临床特征等）人群中验证GWAS的结果。借鉴国际经验结合国内实际情况，在进行此类研究过程中特别需要注意的问题有以下两点：（1）强调不同部门的分工协作：根据国际经验，无论是原创性的GWAS还是易感位点的重复性验证，此类研究工作一般由项目管理、表型确定、基因分型、数据分析、解释结果几个方面的专业人员合作完成，因此，不同专业研究人员严密的分工协作很重要；（2）面对我国丰富的遗传资源，应注意细化GWAS：我国T2DM患者人数居世界之最，完全有可能从多从细予以利用，是影响GWAS的重要因素，国内的GWAS研究应注意民族、种群以及在此基础上表型和亚表型的细分，从而减少人群混杂、细化GWAS并扩展GWAS成果。三、开展T2DM易感基因研究的意义1.T2DM易感基因研究的价值：尽管目前已被发现的T2DM易感基因越来越多，但是这些基因OR值多在1.1～1.2之间，对疾病遗传性的解释也总共仅有10%。相关研究发现无论是在欧洲人群还是中国人群中，这些易感基因对T2DM的预测价值仅与性别、年龄和体质指数相当，即使联合这些易感基因与性别、年龄和体质指数，也仅能使ROC曲线下面积提高0.05，可见目前T2DM的基因预测还很不成熟，但易感基因可以为探索疾病发生机制以及寻找药物靶点提供线索，这些基因对于发现一些以前未被发现的可能改变β细胞功能、胰岛素活动或其他代谢活动的生物学通路有很好的提示作用。我们可以研制相应药物以掩盖这些易感基因在其所在生物通路上发挥的作用。比如较早发现的糖尿病易感基因PPAR-γ和KCNJ11分别是糖尿病治疗药物格列酮类和磺脲类的治疗靶点。在新发现的易感基因中是否存在新的治疗靶点还需深入研究。应当提醒的是，利用易感基因寻找药物作用靶点的过程同样可能会遇到一些问题，比如TCF7L2基因的发现则使研究者关注到WNT信号通路在T2DM的发病机制中的作用，但由于这条通路在普通细胞的发育和功能上都有核心作用，发现高选择性的药物靶点可能会很困难。因此，要真正实现T2DM的基因预测和个体化用药，还有很多工作要做。2.开展中国人自己的T2DM易感基因研究：T2DM的发病有明显种族差异，这种差异是由不同种族间生活方式和遗传背景的不同共同造成的。中国人的T2DM易感基因谱与白种人可能存在着较大的异质性。因此，在中国人中深入开展研究将有希望发现更多的T2DM易感基因，且具有重要的科研价