新药发现和发展的新途径：天然产物的生物合成和组合生物合成研究

新药发现和发展的新途径：天然产物的生物合成和组合生物合成研究生命有机国家重点实验室中国微生物学会学术年会：Nat.Prod.Rep.2005,22,162-195;J.Nat.Prod.2004,67,2141-2153;

J.Nat.Prod.2003,66,1022-1037;J.Nat.Prod.1997,60,52-60天然化合物（1％）新型药物（24-40％）新药发展的主要来源：天然产物AnticancerandAntibacterialDrugs:~70%;2000~2003:

15NewNaturalProduct-DerivedDrugsLunchedand15NaturalProduct-DerivedCompoundsinPhaseIIIClinicalTrailsorRegistration.以天然产物为基础发展药物的方法获得新型结构和生物活性的抗生素变得越来越难一.自然分离合成步骤繁多合成产率低下二.化学合成以微生物作为“细胞工厂”，通过对代谢途径的遗传控制，生物合成所需要的新型药物。以微生物为对象研究生物合成的优势微生物产生大量具有生物活性的次生代谢产物；易于培养、生长迅速、代谢旺盛，适合采用发酵的方法大量积累代谢产物；遗传背景相对简单，细胞内DNA重组技术手段相对成熟。0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.5(kb)StructureGeneResistanceGeneRegulatoryGene天然底物吸收合成天然代谢产物输出调节环境因素＋_代谢途径酶催化反应天然产物的次生代谢（生物合成）途径信号传导竞争拮抗环境适应抗性和耐药机制微生物生物化学问题：次生代谢途径存在哪些生化反应？生化反应的酶学机制是什么？生化反应如何协作参与抗生素形成？微生物遗传学问题：连续的酶催化反应如何调控？生物体如何逃避抗生素对自身的伤害？插入置换缺失药物组合生物合成基因库重组微生物库“非天然”天然化合物库生物合成基因簇不同来源的生物合成基因微生物组合生物合成：次生代谢途径的遗传修饰与化学结构的多样性PCR获得PKS或NRPS基因片段突变株遗传转移系统探针发酵检测基因文库生物合成基因簇的克隆酶学反应、调控和抗性机制等次生代谢生物合成途径的建立代谢途径的遗传修饰应用于新药发现和发展组合生物合成微生物学分子生物学遗传学、生物化学和化学研究策略出发点！核心！应用！目标！目前拟开展研究的课题：新型聚酮和聚肽类抗生素的次生代谢生物合成研究Nacathiacin:Anti-bacteriaSanglifehrinA:ImmunosuppressantTetrocarcinA:Anti-tumorChlorothricin1:Anti-bacteriaAzinomycinB:Anti-tumorSaframycinA:Anti-tumor例一：聚酮类Spirotetronate抗生素的生物合成研究ProducedbyStreptomycesantibioticusTü99;

Antibioticactivity:againstgram-positivebacteria(Inhibitorofpyruvatecarboxylase);Cholesterolbiosynthesisinhibition.ProducedbyMicromonosporaChaldeaKY11091;*AnticancerActivity*AntibacterialActivity以T-ALL和B-CLL肿瘤模型的细胞凋亡实验表明，TC-A可能诱导一条新的细胞信号传导途径。PKS聚酮类：E2A3A4A5A6E3LMD1D2/D3/D4/36-3-2-10C7B1B4B2B3/H/B5/B6/C5/C4/C3/I/JF1GF2/KC2C1C6E1A1A2Chlorothricin生物合成基因的克隆35Enzymes!51Reactions!!Chlorothricin的次生代谢生物合成途径Jia,X.+;Zhao,Q.+;Tian,Z.;

Tang,G.*&Liu,W.*+.Chem.&Biol.submitted.刘文，唐功利，贾新颖。Patentnumber:200510027456.8

.Chlorothricin生物合成代谢途径中的生化问题重复使用（Iterative）TypeIPKS的生物化学机制；特殊3－C单位的生物合成途径；催化Diels－Alder反应的新型天然酶的发现；Baeyer－Villiger单加氧反应的酶学机制和在有机合成中的应用；糖苷转移酶的定向进化Liu.W.etal.

Chem.Biol.

2005,12,1;Gaiser,S.etal.

J.bacteriol.

1997,179,6271;Aherlt,J.etal.

Science

2002,297,1173.生物化学研究内容一：IterativeTypeIPKS负责芳环类聚酮化合物的生物合成的特例OrsellinicacidNaphthoicacidKSATDHACPKSATDHACPKSATDHACPKRKSATDHACPKRAviMCalO5NcsBChlB1OrsellinicacidNaphthoicacidMethylsalicyclicacidAVICALNCSCHL生物化学研究内容一：IterativeTypeIPKSKSATDHACP(KR)NcsBCalO5AviMChlB1OliPKS-6OliPKS-2OliPKS-5OliPKS-4OliPKS-3OliPKS-1IterativeTypeIPKSNon-IterativeTypeIPKSA.IterativeTypeIPKSB.Non-IterativeTypeIPKSShao,L.;Qu,X.;Jia,X.;Zhao,Q.;

Tang,G*.&Liu,W*.

Mol.Microbiol.

Manuscriptinpreparation生物化学研究内容一：IterativeTypeIPKS运用PCR手段直接克隆IterativeTypeIPKS的方法建立KSATDHACPKSATDHACPKSATDHACPKRAviMCalO5ChlB1KSATDHACPKRNcsBKSATDHACPKRAziB1NcsBAziB1ChlB1CalO5AviMR=OHorHR=OHorH生物化学研究内容一：IterativeTypeIPKS需要解决的科学问题：1.决定KR选择性还原的因素；2.决定聚酮中间产物长度的因素；3.与典型TypeIPKS在催化机制上的区别。010.020.030.0min100010001000mAU,UVat222nmWTChlD3mutantchlD4mutant生物化学研究内容二：特殊3－C单位的生物合成途径Jia,X.+;Tian,Z.;Tang,G.*&Liu,W.*+.

Unpublished.生物化学研究内容三：Baeyer－Villiger反应在有机合成中的应用chlE1orchlE3chlE1andchlE3的异源表达；体内敲除对功能的证实；对于TC-A的体内转化；有机合成领域应用的尝试。ChlF1:TetR家族调节蛋白；ChlF2:双因子家族调节蛋白。7个转录调节单位！！！核心问题：ChlF1和ChlF2如何途径特异性地控制CHL生物合成基因的协同表达。微生物遗传学研究内容：CHL生物合成的调节和抗性控制F1GF2P1P2P3P4P5P6ChlG:运输转移蛋白矛盾问题：大量CHL产生后仍然存在于细胞内！CHL抗感染机制：丙酮酸羧化酶核心问题：CHL产生菌如何避免存在于体内的CHL细胞毒性。组合生物合成的遗传基础：基因---蛋白酶---化学结构E2A3A4A5A6E3LMD1D2/D3/D4/36-3-2-10C7B1B4B2B3/H/B5/B6/C5/C4/C3/I/JF1GF2/KC2C1C6E1A1A211235512.520.027.5min1000mAU,UVat222nmWTSDchlD4mutantchlB6mutant1:Chlorothricin(CHL)2:dechloro-CHL3:demethylsalicycloyl-CHL100010001000CHL生物合成途径的遗传修饰：新型结构类似物的获得13Jia,X.+;Tian,Z.;Tang,G.*&Liu,W.*+.

Unpublished.揭示组合生物合成的天然途径例二：抗肿瘤生物碱类抗生素SaframycinA的组合生物合成研究SafracinSaframycinAEcteinascidin743Producedby:PseudomonasFluorescensA2-2Producedby:StreptomyceslavendulaeProducedby:MarineTunicate＜＜＜＜ID50=0.2-0.6nMNRPS聚肽类：ORF:1357911131517192123252729313302468101214161820222426283032Sac:JIABCDEFGHGeneClusterofSaframycinAFromStreptomyceslavendulaeGeneClusterofSafracinFromPseudomonasflurescensA2-2MolecularMicrobiology2005,56,144-154Li,L.+;Deng,W.+;Song,J.;Tang,G.*&Liu,W*+.

unpublished.Streptomyceslavendulae菌中SaframycinA的生物合成途径Sac:JIABCDEFGH(ORF:8916171819212230)P2P1ORF:121333111/10+Safracin