木豆叶芪类提取物对大鼠骨损坏的保护作用

木豆叶芪类提取物对大鼠骨损坏的保护作用

植物中的雌激素具有抗骨损伤的作用，但没有雌激素副作用，因此受到广泛关注。各国科学家都在积极寻找安全有效的、具有雌激素样作用的天然产物。已经发现的这类植物雌激素有异黄酮、木酚素、香豆素、二苯乙烯类等,在多种植物和中草药中均含有这些化合物。木豆(CajanuscajanL.)是豆科木豆属植物,又名柳豆、豆蓉、扭豆。分布于东南亚、印度、缅甸及我国云南、四川、江苏、广东、广西和海南等省。海南岛各地有野生和栽培。用木豆叶治疗外伤和烧伤感染及褥疮等有较好的疗效。近年来有报道显示,木豆叶具有提高血清钙、磷含量,促进已发生坏死的股骨头内的骨组织血管、骨髓的修复再生,使血管枯死的股骨头内再血管化的作用。但其有效成分和作用机制尚不清楚。木豆叶芪类提取物(stilbeneextractsofCajanuscajanL.,sECC)为混合物,其主要成分是木豆素A、木豆素、木豆素C,均属于二苯乙烯衍生物。本研究采用雌性大鼠去除双侧卵巢方法,建立由雌激素水平降低引起的骨丢失大鼠模型,观察木豆叶芪类提取物对大鼠血清激素水平、子宫重量及股骨骨小梁结构的影响,从而探讨木豆叶芪类提取物对雌激素水平降低引起的骨质丢失的保护作用。大鼠骨国土相关指标的测定实验动物雌性Wistar大鼠(二级)3月龄,60只,体重(232.7±11.0)g;购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场,动物合格证号SCXK京2000-0008(0044795)。给药期间饲养于本所清洁级动物房。试剂和材料木豆叶(CajanuscajanL.)采自海南省琼山县,鉴定人为林寿全教授,标本保存地为中国医学科学院药用植物研究所标本馆。木豆叶芪类提取物由中国医学科学院药用植物研究所植物化学室陈迪华教授提供。将木豆叶原料粉碎后,用80℃90%乙醇浸泡抽提3次,每次1.5h。然后,真空浓缩成膏,使其芪类总成分含量为50%。血清17β-雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)及黄体生成素(LH)放射免疫测定试剂盒均购自北京北方生物技术研究所。去卵巢大鼠骨丢失模型采用去除大鼠双侧卵巢造成骨丢失模型。假手术组大鼠只分离双侧卵巢,切除卵巢附近相当于卵巢大小的脂肪组织。各组大鼠均在大腿肌内注射青霉素(8×105u/瓶),0.5mL/只。动物分组将动物分成6组:①假手术对照组(n=8);②骨质丢失模型组(n=11);③17β-雌二醇0.5mg·kg-1组(n=11);④木豆叶芪类提取物50mg·kg-1组(n=10);⑤木豆叶芪类提取物100mg·kg-1组(n=10);⑥木豆叶芪类提取物200mg·kg-1组(n=10)。假手术组和模型组大鼠给予去离子水10mL·kg-1。大鼠卵巢切除两周后,开始给予17β-雌二醇、木豆叶芪类提取物或去离子水,灌胃1次/天,6天/周,连续8周。血清激素水平给药结束后,以3%戊巴比妥麻醉大鼠,开腹后,在腹主动脉分叉处用注射器穿刺取血。全血置离心管中,4℃放置2~3h后,2000r·min-1离心5min。取血清以放射免疫法测定血清中17β-雌二醇、卵泡刺激素和黄体生成素含量。均按试剂盒说明书操作。子宫重量和卵巢重量、骨病理切片检查取子宫和卵巢称湿重。取双侧股骨,去除肌肉和结缔组织,采用石蜡包埋HE染色法观察股骨病理改变。大鼠股骨病理形态主要观察骨骺板的平整与密集(软骨细胞的增生及退化),成骨细胞的钙化(条索排列的状况)及骨形成。与假手术组大鼠的骨结构接近为++,一般为+,差为±。统计学处理实验结果均以x¯±sx¯±s表示。所有计量资料均采用t检验。病理样本的计数资料以每组样本中不同病理变化等级所占百分比表示。结果1木豆叶治疗大鼠精子重量与假手术组相比,实验结束时,模型组大鼠平均体重增加18.2%。给药8周后,17β-雌二醇、木豆叶芪类提取物各组大鼠体重较模型组略有降低。与模型组相比,17β-雌二醇组大鼠子宫重量增加108.3%。x¯±s.∗P<0.05vsx¯±s.*Ρ<0.05vsshamgroup;$P<0.05,$$P<0.01vsOVXgroup与17β-雌二醇组不同,木豆叶芪类提取物各剂量组大鼠的子宫重量与模型组相比并无明显增加。提示,木豆叶芪类提取物对子宫组织无刺激作用(表1)。2木豆叶治疗大鼠血清17-成虫二醇含量的影响与假手术组相比,模型组大鼠血清17β-雌二醇含量降低45.7%;而FSH和LH则分别增加11%和6%。给予17β-雌二醇8周后,与模型组相比,大鼠血清17β-雌二醇含量增加57.7%,FSH降低11.5%,LH降低20.7%。木豆叶芪类提取物200mg·kg-1剂量组与模型组相比,血清17β-雌二醇含量无明显增加,但FSH和LH浓度则分别降低11.5%和15.2%。结果表明,木豆叶芪类提取物可以逆转由于血清17β-雌二醇水平降低所引起的FSH和LH的升高,有类似雌激素的作用(表2)。3木豆叶治疗大鼠骨小梁的组织结构由骨病理切片可以看出,假手术组的骨小梁较粗,排列整齐并连接成网,间隙较小。模型组大鼠的骨小梁变细,其间连接较少,可见骨小梁不连续,小梁间隙增大。17β-雌二醇组的骨小梁无明显x¯±s.∗P<0.05vsx¯±s.*Ρ<0.05vsshamgroup;$P<0.05vsOVXgroup变细,排列整齐。与模型组相比,木豆叶芪类提取物100mg·kg-1剂量组的骨小梁略变细,排列尚整齐,并连接成网,部分区域骨小梁间隙略增大,骨小梁面积无明显减少。木豆叶芪类提取物200mg·kg-1剂量组的骨小梁无明显变细,且排列较整齐,连接成网,类似17β-雌二醇组(图1)。各组每个股骨样本的计数资料显示,17β-雌二醇组有82%大鼠股骨的骨丢失得到了恢复。木豆叶芪类提取物200mg·kg-1剂量组为60%大鼠股骨的骨丢失得到了恢复;100mg·kg-1剂量组则是30%有改善。结果表明,木豆叶芪类提取物可以抑制骨丢失,具有维持骨小梁结构完整的作用(表3)。++:Bonestructureisthickandlargewitharrangementinorder;+:Trabeculaearethin,narrow,andshortwithbigholeinside;±:Trabeculaearemuchthinnerandsmaller木豆叶治疗大鼠骨小梁和激素的作用本研究中,17β-雌二醇组的剂量是常规给药的一半,但仍能明显增加血清17β-雌二醇水平,子宫重量也明显增加。然而,给予木豆叶芪类提取物后,血清中17β-雌二醇水平没有明显变化,但可降低FSH及LH水平。结果表明,木豆叶芪类提取物具有类似17β-雌二醇的作用,逆转了因17β-雌二醇缺乏所引起的FSH及LH的升高,且不增加子宫重量,这一表现与补充雌二醇所产生的作用明显不同,但与已知的植物雌激素作用类似。更有意义的是,中、高剂量的木豆叶芪类提取物可以剂量依赖性地抑制大鼠股骨头部位的骨丢失。表现为