木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤pc12细胞的保护作用

木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤pc12细胞的保护作用

抑郁是一种精神疾病，具有高度的发病率、致死率和复发。临床研究表明抑郁症病人的下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamicpituitaryadrenalaxis,HPA)功能亢进,血中糖皮质激素水平显著升高。而持续高浓度糖皮质激素可以导致淋巴细胞、皮层及海马神经细胞损伤。PC12细胞株为大鼠肾上腺嗜铬细胞克隆化细胞株,分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征,其胞膜上糖皮质激素受体表达丰富。用高浓度的皮质酮诱导PC12细胞损伤,已成为研究抑郁症的一种常用体外模型。木豆叶为豆科木豆属植物木豆[Cajanuscajan(L.)Millsp.]的干燥叶子。现代研究表明木豆叶主要成分有芪类和黄酮类化合物,具有抗骨质疏松、降血脂、抗老年性痴呆等多种药理活性。而木豆叶提取物对皮质酮损伤的PC12细胞的保护作用,国内外未见文献报道。本研究用高浓度的皮质酮与PC12细胞共同孵育,模拟抑郁症病人的大脑神经元损伤状态,以此观察木豆叶醇提物及不同组分对神经细胞的保护作用,为木豆叶中抗抑郁新药研发提供科学依据。1材料表面1.1特芬材料木豆叶采自广西凤山县,经中国医学科学院药用植物研究所张本刚教授鉴定为木豆属植物木豆的干燥叶子。1.2清、dmem高糖培养基大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞(上海细胞库);精制胎牛血清、DMEM高糖培养基(Gibco公司);二甲基亚砜DMSO、MTT、Corticosterone(Sigma公司);LDH检测试剂盒(STANBIO,USA)。1.3仪器纯水仪(美国Millipore公司);二氧化碳培养箱(NAPCO6500TC法国);连续波长酶标仪(美国BIO-TEK)。2方法2.1乙醇浸膏溶液用80%乙醇回流提取干燥木豆叶3次,每次1h,合并滤液,减压回收乙醇,即得乙醇浸膏。乙醇浸膏溶解后,与硅胶拌匀,干燥;用索氏提取器提取,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和95%的乙醇洗脱,分别减压浓缩即得石油醚洗脱部位(PEP)、二氯甲烷洗脱部位(DMP)、乙酸乙酯洗脱部位(EAP)和乙醇洗脱部位(EP)。2.2细胞培养和活性PC12细胞液置于15mL的离心管中,1000rpm,离心5min,弃上清液,将细胞用含有5%胎牛血清和10%马血清的高糖DMEM培养基悬浮,分装于25mL的培养瓶中,置于37℃的二氧化碳培养箱中培养,每2～3d换液1次。2.3mtt法检测细胞活力PC12细胞培养至对数生长期,用含5%胎牛血清、10%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU/L,链霉素100mg/L,pH7.4)重悬细胞,调细胞浓度为每毫升1×105个。细胞接种于96孔板中,各孔加入100μL细胞液,置于37℃、CO2培养箱中贴壁培养2～4d,待细胞长满孔底后即可用于实验。加入不同浓度的皮质酮(0.01、0.1、1、10、100μmol/L),作用12、24和48h后,用MTT法检测细胞的活力,利用酶标仪在570nm处测定各组细胞吸光度A值。以对照组平均吸收值为100%,以各处理组吸收值与对照组的比值计算存活率。2.4mtt法检测细胞存活率将PC12细胞以每毫升约1×105个接种于96孔板(每孔100μL),正常培养24h后加入终浓度100μmol/L皮质酮损伤PC12细胞48h,加入不同浓度(12.5,25,50,100,200μmol/L)的木豆叶醇提物及不同组分作用24h后,用MTT法检测细胞存活率,在多功能酶标仪上测定570nm的吸收度值。2.5皮质酮损伤细胞的ldh活性测定细胞以每孔1×105个接种于24孔中,培养24h后加入100μmol/L的皮质酮损伤细胞48h,加入不同浓度的木豆叶醇提物及不同组分作用24h后,收集细胞上清液,按照说明书的方法测定LDH活性。2.6处理数据应用SPSS17.0统计软件进行数据处理,实验数据以x¯±sx¯±s表示,单因素ANOVA(方差分析)方法进行显著性检验。3结果3.1mol/l浓度对cort作用pc12细胞存活率的影响实验结果显示皮质酮对PC12细胞的损伤程度随浓度和时间呈依赖性上升,10μmol/L和100μmol/L浓度的CORT作用PC12细胞12h时,其细胞存活率分别为94.3%和89.8%,作用24h后分别下降为92.6%和86.9%,至48h后,其细胞存活率72.6%和47.5%。详见图1。因此,本研究中采用100μmol/LCORT作用48h建立PC12损伤模型。3.2细胞形态变化形态学结果显示,100μmol/L的皮质酮与PC12细胞孵育48h后,细胞形态发生了显著的变化,表现为突起断裂,包膜不完整,胞体膨胀,胞核固缩(详见图2a,2b);再加入不同浓度的木豆叶醇提物对细胞损伤有一定的逆转作用(详见图2c,2d)。3.3克氏原螯虾体内细胞的功能MTT结果显示木豆叶醇提物、石油醚洗脱部位和乙酸乙酯洗脱部位在100～12.5mg/L对皮质酮损伤的细胞表现出明显的保护作用,50mg/L达到最大值;二氯甲烷部位在50～12.5mg/L有明显的保护作用;而乙醇部位在200～12.5mg/L均表现出明显的活性且其活性的大小有明显的剂量依赖关系。然而,高浓度(200mg/L)的木豆叶醇提物、石油醚部位、二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位对细胞产生明显的毒性作用。详见表1。3.4细胞保护作用乳酸脱氢酶(LDH)释放法,进一步证实木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤的PC12有细胞保护作用。木豆叶醇提物100～12.5mg/L、石油醚部位50～12.5mg/L、二氯甲烷部位50～12.5mg/L、乙酸乙酯部位50～12.5mg/L和乙醇部位100～50mg/L处理24h,能显著的降低了LDH的释放率,结果见图3。4木豆叶醇提物对皮质酮损伤的保护作用本研究采用高浓度皮质酮损伤体外培养的PC12细胞,模拟慢性心理应激抑郁时糖皮质激素升高的状态作为抗抑郁药的筛选模型。结果表明,当皮质酮浓度为100μmol/L,作用48h,PC12细胞生长状态差,悬浮细胞明显增多,细胞存活率低于正常细胞,可以在一定程度上体现抑郁模型的病理特征。本研究采用皮质酮损伤的PC12作为筛选模型,以MTT和LDH两种方法检测,研究木豆叶醇提物及不同组分对细胞损伤的保护作用,结果表明在浓度(50mg/L)各个部位不但能逆转皮质酮对PC12细胞造成的损伤,且能促进细胞的增殖,并且发现醇提物的活性最好。木豆叶主要含芪类和黄酮类化合物。而芪类化合物主要含木豆素、木豆素A、木豆素C等脂溶性成分,黄酮类化合物以木犀草苷、牡荆苷等水溶性成分为主。本研究石油醚洗脱部位、二氯甲烷洗脱部位和乙酸乙酯洗脱部位主要含芪类等脂溶性成分,而乙醇部位以水溶性黄酮为主。近年来研究表明,芪类化合物具有抗骨质疏松、降血脂和改善阿尔茨海默病(AlzheimerD