微量量热法研究麻黄汤与麻杏石甘汤的生物热力学对比

微量量热法研究麻黄汤与麻杏石甘汤的生物热力学对比

麻黄汤和麻杏石甘汤是著名的中医方剂，均源于汉代张仲景的“伤寒论”。其中,麻黄汤由麻黄、桂枝、杏仁、甘草4味中药组成,具有辛温解表,宣肺平喘的功效,主治太阳伤寒表实证;麻杏石甘汤由麻黄、杏仁、石膏、甘草组成,具有辛凉解表、宣肺平喘之功效,主治肺热咳喘症。二药仅一味之变而致全方寒热药性发生改变。为了探讨二药药性改变的客观依据,本研究选取麻黄汤和麻杏石甘汤作为研究对象,以金黄色葡萄球菌作为生物模型,采用生物热力学的主要研究方法-微量量热法研究了药物对金黄色葡萄球菌的代谢影响,通过测定其药液对细菌代谢的热功率-时间(P-t)曲线,得到了受试菌代谢的生长速率常数、最大发热功率等一系列热动力学参数,由此分析麻黄汤和麻杏石甘汤的药性差异,并探讨其药性的客观真实性。1材料表面1.1热活性的测定采用瑞典Thermometric公司产TAMAirIsothermalCalorimeter测定。该热活性检测仪配置PicoTC-80数据采集和分析软件。实验时系统控温于37℃。1.2中国培养物保藏中心金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(CCTCCAB910393)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供;培养基采用LB液体培养基,取NaCl5g,酵母膏5g,蛋白胨10g,溶解于1000mL蒸馏水中,调pH至7.0~7.2后分装。121℃高压蒸气灭菌30min,冷却后放置冰箱中备用。1.3试剂的制备方法麻黄、桂枝、杏仁、甘草及石膏药材均由解放军第302医院中药房提供,并经肖小河研究员鉴定符合《中国药典》2005年版规定。所有试剂均为分析纯。麻黄汤和麻杏石甘汤水煎剂的制备:按配伍比例,分别称取麻黄汤和麻杏石甘汤,10倍水浸泡30min,煎煮1h,共煎2次,合并滤液,浓缩干燥得浸膏,4℃冰箱保存备用。测定时以无菌水制成每毫升相当于原生药1g的混悬液,得初始药液质量浓度为1g·mL-1。2热功率-时间曲线法本实验采用安瓿法,采用无菌操作将金黄色葡萄球菌接种于100mL培养基中,菌接种量为1×106个/mL,摇匀后向每个安瓿瓶中精确加入10mL细菌培养基溶液,然后加入一定量药液,加盖瓶塞,密封后放入微量量热仪中跟踪记录金黄色葡萄球菌生长代谢过程热功率-时间曲线(P-t图),当曲线重新返回基线时,实验结束。3结果3.1生长代谢产热曲线测定在37℃下,采用安瓿法测定了金黄色葡萄球菌生长代谢产热曲线,同时测定了其在麻黄汤和麻杏石甘汤药物作用下的生长代谢产热曲线(图1,2)。在相同的实验条件下,实验结果有良好的重现性。3.2细菌指数调空的动力学模型由于安瓿瓶中特殊生长环境,细菌的整个生长过程处于恒温恒压的条件下,养分和氧气的供应量有限。然而,在运用微量量热技术研究细菌的生长动力学时发现,在新鲜培养基中,当接种量很小时,在生长初期,能近似满足无限制生长条件,热曲线呈现出指数生长特征。据此,在分析细菌指数生长期热曲线的基础上,建立了细菌生长的热动力学模型,即在细菌细胞的生长过程中,其指数生长期内的产热功率与培养时间之间符合公式:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+ktP0和Pt分别是细菌的指数生长的初始点和t时的热功率,将热谱曲线上的指数生长期的Pt,t值代入公式中,用计算机进行线性拟合可以得到金黄色葡萄球菌的生长速率常数(k)值(见表1),以及在不同浓度药物作用下的生长速率常数(见表2)。由表1可得k=(0.02526±0.000402)min-1,相关系数R均大于0.9950,可见其结果有很好的重现性和相关性。同时由tG=In2/k,可求得不同条件下的细菌传代时间。金黄色葡萄球菌在不同浓度药物作用下的生长速率常数、传代时间tG和生长期的最大发热功率Pmax及出峰时间tp如表2所示。3.3药物作用下的抑制率细菌生长抑制率I(%)=[(k1-k2)/k1]×100%,式中k1为对照组细菌的生长速率常数,k2为细菌受到药物抑制时的生长速率常数;当抑制率为50%时所对应的药物浓度为半抑制浓度IC50。根据以上定义,计算了金黄色葡萄球菌在不同浓度的药物作用下的抑制率(I),其结果如表2所示。同时根据以上定义,由表2可见,麻黄汤对金黄色葡萄球菌的半抑制浓度为33.4mg·mL-1,而麻杏石甘汤对金黄色葡萄球菌的半抑制浓度降低为25.3mg·mL-1。3.4麻黄汤k-c线性回归模型由表2可见,麻黄汤与麻杏石甘汤作用于金黄色葡萄球菌,随药物浓度的增加,金黄色葡萄球菌的生长均受到抑制,指数生长期的k减小。将k对C作线性回归(见图3),并用计算机对k-C数据进行线性拟合,得到k与C之间的关系式分别为:麻黄汤k=-0.0004C+0.026,r=0.9961;麻杏石甘汤k=-0.0005C+0.0253,r=0.9880。3.5功率pmisa影响由表2可见,随着药物浓度的增加,金黄色葡萄球菌的传代时间tG增加,生长期的最大发热功率Pmax随之减小。以Pmax对k进行线性拟合(见图4),Pmax与k呈正相关,Pmax与k的关系式分别为:麻黄汤Pmax=31211k-62.161,r=0.9992;麻杏石甘汤Pmax=26154k+24.78,r=0.9779。4不同药物作用的分离效果细菌生长速率常数k值是表征细菌生长代谢过程的特征常数之一,在条件相同而加入不同抑制性药物或改变药物的浓度时,k值的改变可作为评价药物抑菌效果大小的参数。本研究表明,麻黄汤与麻杏石甘汤均能不同程度地抑制金黄色葡萄球菌的生长,且随着药液浓度的增加,其抑菌作用逐渐增强。其中,温热药方麻黄汤较寒凉药方麻杏石甘汤对金黄色葡萄球菌的抑制作用相对弱,具体表现为麻黄汤作用于金黄色葡萄球菌时,其指数生长期生长速率常数降低幅度小,传代时间延长少,最大产热功率较大;而麻杏石甘汤作用于金黄色葡萄球菌时,其指数生长期生长速率常数降低幅度大,传代时间延长多,最大产热功率较小,表明两者存在较稳定的差异。同时,本研究还表明,麻黄汤较麻杏石甘汤对金黄色葡萄球菌生长代谢的热输出相对较高,说明二者的药性差异是客观存在的,这与有关寒热药性研究的文献报道相吻合,即温热药可提高机体神经