二氢杨梅素抗脂质过氧化作用的研究

二氢杨梅素抗脂质过氧化作用的研究

腾腾茶是一种又名显齿蛇葡萄的野生藤本植物。它具有抗炎、抗菌、止咳、镇痛、肝脏、残余物等功效。藤茶中已分离出一些化学成分,其中含量最高的是二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)。药理研究表明,DMY能对抗去肾上腺素和高K+所致的兔胸主动脉条的收缩反应及显著扩血管和钙拮抗作用;具有祛痰止咳、降血脂、保肝作用。但其清除氧自由基与抗脂质过氧化作用尚未见详细报道。实验研究DMY对体外氧自由基发生系统诱导离体大鼠脑、心、肝线粒体脂质过氧化作用。1材料和机器1.1研究试剂和试剂MDA测定试剂盒,四乙氧基丙烷(TEP),浓度10nmol·mL-1,南京建成生物工程研究所;EGCG(批号E-024-113,spec98%min),湖南金农股份有限公司提供;所用试剂均为国产分析纯或生化试剂。二氢杨梅素,白色结晶,从藤茶中提取,经HPLC测定,其含量不低于95%,湖南中医学院中药化学教研室制备。1.2仪器、检测方法岛津UV-265FW分光光度计,751DG紫外分光光度仪(上海仪器总厂);HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂);GL20A全自动高速冷冻离心机;TD4A台式离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂)。1.3动物Wistar大鼠,雄性,体重200～250g,由湖南中医学院实验动物中心提供。2方法2.1dmy的生物活性化取正常大鼠禁食1夜,脱臼处死,迅速取出肝脏、脑、心,用冰冷的生理盐水漂洗,滤纸拭干,用冷生理盐水在内切式组织匀浆器中制成10%组织匀浆,1000r·min-1离心10min,取上清液0.5mL,给药组每管分别加入不同浓度的DMY,用生理盐水补充至1mL,使DMY终浓度分别为(5,10,20μmol·L-1),对照组加等体积的生理盐水,于37℃恒温振荡孵育1.5h后,各管加入20%三氯乙酸1mL终止反应,加0.67%TBA1mL,混匀后沸水浴中加热反应15min,取出后流水冷却。然后1000r·min-1离心10min,用移液器吸取上清液加入比色皿中,于532nm测定吸收度(A),根据MDA的摩尔吸光系数ε=1.56×105mol-1·L计算匀浆脂质过氧化产物MDA的生成量,以nmol·g-1组织为计量单位,并计算抑制率。MDA抑制率(%)=(对照组A值-给药组A值)/对照组A值×100%2.2影响2kgpet-fe2大鼠骨骼氧化损伤2.2.1转化分质剂的制备参照文献,以分级沉淀差速离心法分离。将制备的各组织的线粒体蛋白浓度分别用冰冷的生理盐水调至5g·L-1,储存于4℃冰箱备用。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。2.2.2药物吸收值wpbs参考Martens方法,反应终体积3.0mL,含有1.0mg肝线粒体蛋白,100μmol·L-1VitC,50μmol·L-1Fe2+及各种浓度的药物,用pH7.4,0.1mol·L-1PBS补足至3mL,37℃恒温水浴条件观察1h内520nm处吸收值的变化。吸收度下降表示线粒体膨胀增加。2.2.3mda的生成抑制率测定,使用者以适应不同浓度的药物。以密反应液总体积1mL,含有0.5mg各种组织的线粒体悬液,0.1mmol·L-1Cys,0.02mmol·L-1Fe2+及各种浓度的药物,用pH7.4,0.1mol·L-1PBS补足至1mL(对照组用PBS代替),混匀后,37℃恒温振荡孵育1h,取出0.2mL样品,按试剂盒说明书采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量,计算MDA生成抑制率。2.2.4mda的生成抑制率测定反应液总体积1mL,含有0.5mg各种组织的线粒体悬液,0.3mLEDTA(1mmol·L-1),0.1mLH2O2(4mmol·L-1),0.3mLFe2+(1mmol·L-1)及各种浓度的药物,用pH7.4,0.1mol·L-1PBS补足至1mL(对照组用PBS代替),混匀后,37℃恒温振荡孵育1h,取出0.1mL样品,按试剂盒说明书采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量,计算MDA生成抑制率。2.2.5mda的生成抑制率测定—对VitC-Fe2+诱导的大鼠线粒体脂质过氧化反应液总体积1mL,含有0.5mg各种组织的线粒体悬液,抗坏血酸50μmol·L-1,Fe2+25μmol·L-1,及各种浓度的药物,用pH7.4,0.1mol·L-1PBS补足至1mL(对照组用PBS代替),混匀后,37℃恒温振荡孵育1h,取出0.1mL样品,按试剂盒说明书采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量,计算MDA生成抑制率。3结果3.1肝脏功能结构的研究DMY对正常离体大鼠脏器组织过氧化脂质的生成均有极显著的抑制作用,并随剂量增加作用增强,而且对肝脏的脂质过氧化反应的抑制作用最强,这可能与肝脏具有物质代谢等多种功能的组织结构有关(如肝脏富含线粒体、内质网和高尔基复合体,分别与肝细胞进行功能活动的能量提供、蛋白质合成和糖原合成密切相关)。当DMY浓度为10.0μmol·L-1时,对3种组织匀浆中MDA生成的抑制作用比相同浓度的EGCG稍低,结果见表1。3.2脂质过氧化与线虫膨胀线粒体肿胀程度与线粒体的生理和病理性反应有关,过度的肿胀则是线粒体损伤的表现。线粒体膨胀与脂质过氧化有关。脂质过氧化导致线粒体膜脂质及蛋白质组分改变,进一步改变膜的屏障功能,引起线粒体呼吸状态的改变,使线粒体悬液A520nm下降。DMY具有抑制脂质过氧化,保护线粒体结构的作用,结果见图1。4dmy对vitc-fe2+等体系诱导的脂质过氧化作用大量研究表明,在正常情况下,人体内氧自由基的产生和清除是平衡的,但在某些病理情况下或人体内抗氧化体系出现故障时,机体内氧自由基产生过多,会引起脂质过氧化,代谢就会出现失衡,导致细胞损伤,引起心脏病、脑缺血、癌症和衰老等严重疾病,影响人们的身体健康。实践证明,抗氧化剂能通过各种途径有效地清除机体内自由基,对自由基所致病变有很好的防治作用。正常脏器的组织匀浆及线粒体在体外受到VitC-Fe2+等体系诱导可使MDA增加。实验观察到DMY对心、肝、脑、组织匀浆及线粒体脂质过氧化产物MDA的生成有强的抑制作用,而且对肝脏的脂质过氧化反应的抑制作用最强,推测DMY对肝脏的保护作用更佳。DMY对Fe2+-Cys体系,H2O2-Fe2+体系诱导的脂质过氧化作用有较强的抑制作用,而在VitC-Fe2+体系中是通过产生·OH而导致脂质过氧化作用,其产生·OH的机理为:Fe2++·O2→Fe3++O2÷O2÷+2H+→O2+H2O2Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-Fe3+在VitC的作用下可被还原成Fe2+,从而促进了·OH的形成,使产生的·OH的量大大增加,因此,DMY对该体系诱导的脂质过氧化作用较弱。一般认为,含酚羟基的化合物具有明显的清除氧自由基的作用,而DMY为含有6-酚羟基的黄酮类化合物,提示其清除氧自由基的作用可能于其带有多个酚羟基有关。由于藤茶中DMY含量高,提取简单,抗氧化作用强,值得进一步研究,以期开发