土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法该实验根据每天的工作量，应保持在28个样为宜，上午14个样，下午14个样，各底物和标样（MUB）均配置50ml，分三等份保存于-20℃冰箱。具体实验步骤整理如下：表1

配置50mlMUB和底物所需质量底物编号EnzymeAbbreviationSubstratem7过氧化物酶PeroxidasPeoL-DOPA3

0.0493g

0.0493g8酚氧化酶PhenoloxidasePhOL-DOPA1α-1,4-葡萄糖苷酶α-1,4-GlucosidaseαG4-MUB2-α-D-glucoside3.3831mg2β-1,4-葡糖糖苷酶β-1,4-GlucosidaseβG4-MUB-β-D-glucoside3.3831mg3纤维二糖水解酶β-D-CellobiohydrolaseCBH4-MUB-β-D-cellobioside5.0045mg4亮氨酸氨肽酶LeucineaminopeptidaseLAPL-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin3.2480mg5β-1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶β-1,4-N-Acetyl-glucosaminidaseNAG4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide3.7936mg6酸性磷酸酶AcidphosphomonoesteraseACP4-MUB-phosphate2.5615mg9β-1,4-木糖酶β-1,4-XylosidaseβX4-MUB-β-D-xyloside3.0828mg脲酶

UreaseUreaseUrea蛋白酶

proteasePROcasein1、Theenzymesinvolvedinthiscyclingprocess2、4-MUB,4-methylumbelliferyl3、L-DOPA,L-3,4-dihydroxyphenylalanine注：L-DOPA为L-3,4-二羟基苯丙氨酸，标准物MUB为4-甲基伞形酮，标准物AMC为7-氨基-4-甲基香豆素。提前一天配置所需试剂:①50mmolL-1醋酸钠缓冲液（pH=5）：4.1015g醋酸钠，去离子水定容至1L。②1MNaOH溶液：2gNaOH，去离子水定容至50ml。③0.3%H2O2溶液：0.5ml30%H2O2，去离子水定容到50ml，保存于50ml离心管。④50ml各底物的配置按照下列公式计算：所需的样品m(mg)=CVM=200uML-1×10-6×V×10-3×M×103其中，M4-MUB-α-D-glucoside=338.31；M4-MUB-β-D-glucoside=338.31；M4-MUB-β-D-cellobioside=500.45；M4-MUB-phosphate=256.15；M4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide=379.36；ML-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin=324.80；ML-DOPA=197.19；标准品M90-33-5=176.17；V=50ml。⑤50ml10uMMUB的配置：先配置50ml100uMMUB母液，百万分之一天平称0.8810mgMUB，去离子水定容至50ml容量瓶，保存于50ml离心管中存储于-20℃冰箱。使用前，吸取5ml100uMMUB母液定容至50ml。实验步骤：①1~6号酶底物是黑板，7、8号是白板。底物编号（1-8）、板子编号（1-32）及样品编号（1-n）格式为1-1-（1,2,3,4,5,6,7）；1-2-（8,9,10,11,12,13,14）；1-3-（15,16,17,18,19,20,21）；1-4-（22,23,24,25,26,27,28）。2-5-（1,2,3,4,5,6,7）；2-6-（8,9,10,11,12,13,14）；2-7-（15,16,17,18,19,20,21）；2-8-（22,23,24,25,26,27,28）以此类推，8-29-（1,2,3,4,5,6,7）；8-30-（8,9,10,11,12,13,14）；8-31-（15,16,17,18,19,20,21）；8-32-（22,23,24,25,26,27,28）。②土壤悬浊液：称1.00±0.02g土样于250ml震荡瓶中→100ml50mmolL-1醋酸钠缓冲液→加小玻璃珠→震荡1h（25℃180rpm）。③将样品悬浊液置于磁力搅拌器→600~1000rpm不断搅拌→黑板横放从1-1板的B行开始加第1个样的200ul悬浊液，C行第2个样品┉┉H行加第7个样品；1-2板的B行开始加第8个样的200ul悬浊液，C行第9个样品┉┉H行加第14个样品；依次类推。白板竖放从H行的第二列开始加第1个样品，每板11个样。表2

黑板加样顺序④

黑板的各A行先加200ul缓冲液→接着1-4列加50ul缓冲液→5-8列

50ulMUB→9-12列50ul底物1（上午：板子1-1、1-2，下午：板子1-3、1-4）并计时，黑暗条件下放置在25℃培养箱中4h→提前1min取出板子全部加10ul

1MNaOH溶液终止反应→立即在A615的荧光多功能酶标仪在激发波长为365nm、发射波长为450nm的条件下测定荧光；以此类推。⑤

PeO：白板的各H-E列先加50ul缓冲液→D-A列加50ul底物7

（上午：板子7-25、7-26；下午：板子7-27、7-28）→全部加10ul0.3%H2O2并计时→黑暗条件下放置在25℃培养箱中5

h→提前1min取出板子全部加10ul

1MNaOH溶液终止反应→立即在A615的荧光多功能酶标仪在450nm的条件下测定可见光光度值。表3

白板7-加样顺序

注：测多酚氧化酶时白板8-29、8-30、8-31、8-32不加0.3%H2O2。⑥：白板的各H-E列先加50ul缓冲液→D-A列加50ul底物8

（上午：板子8-29、8-30；下午：板子8-31、8-32）并计时→黑暗条件下放置在25℃培养箱中24

h→提前1min取出板子全部加10ul

1MNaOH溶液终止反应→立即在A615的荧光多功能酶标仪在450nm的条件下测定可见光光度值。⑧

酶活性（nmol

h-1

g-1）计算过程如下：

PeO和PhO的计算公式如下：

注意事项：A、与底物反应的是土壤悬浊液，而不是浸提液（或上清液）。土壤样品必须置于磁力搅拌器上边搅拌边加样，中间不能停止搅拌，直到96孔板加完样为止。B、所有试剂配置完成后可保存于-20°冰箱7天，配置公式m=C*V*M，百万分之一天平称重。称样前将各试剂从冰箱取出，在冷水中溶解。上午一批次做完后，应将底物暂时置于黑暗条件下，直到下午第二批次加样。C、由于标准品需要量达不到万分之一天平的量程，可适当扩大10倍或100倍，再稀释。D、微孔板A行先加200μL的缓冲液，B~G行加200μL土样悬浊液；X1~X4列加50μL缓冲液，X5~X8列加50μLMUF，X9~X12列加5