黄芩抗细菌抗真菌作用机制的研究进展

黄芩抗细菌抗真菌作用机制的研究进展

黄鼠狼具有清热除湿、清火解毒的功效。主要有效成分有黄鼠狼、汉代黄鼠狼、黄鼠狼和汉代黄鼠狼。研究表明,黄芩及其有效成分具有广泛的药理作用,如抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等,尤以抗细菌/真菌作用最为显著。本文结合课题组近年来对黄芩有效成分的研究,对国内外近来关于黄芩及其有效成分以及含黄芩的中药复方的体内外抗菌研究、抗生物膜研究及其可能的作用机制进行综述。1从中药中挖掘抗菌活性成分近年来,因为抗生素的滥用,耐药菌株的产生已成为临床治疗的最棘手问题。研发新型抗生素需要较长周期,故从中药中挖掘具有抗菌活性的中药或有效组分显得尤为重要。我国丰富的中药资源中有不少中草药对细菌有抑制甚至杀灭作用,研究表明,中药黄芩及其有效组分有显著的体内外抗菌作用。1.1化药成分对e.coli和atp的影响大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)又称大肠杆菌,是人和动物肠道内数量最多的一种革兰氏阴性菌,可导致肠外的化脓性感染和泌尿道感染,少数血清型也可引起胃肠炎。黄芩有较强的抑制E.coli作用。黄衍强等筛选出黄芩等6味中药具有一定的抑制耐药性E.coli作用,0.5g·mL-1和1.0g·mL-1的黄芩提取物抗耐药性E.coli的抑菌圈均大于其他中药提取物。周雪宁等用琼脂二倍稀释法考察了黄芩等3种中药体外抗产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)E.coli作用,得出黄芩抗E.coli的MIC为31.25g·L-1。王娜观察到黄芩有效成分黄芩苷对大肠杆菌的MIC为1.56g·L-1,且黄芩苷的抑菌能力高于黄芪皂苷。董春雷等发现500mg·L-1黄芩素能抑制46.52%的E.coli浮游菌和45.15%生物膜(biofilm)。ChinnamN等认为黄芩素抗E.coli机制可能与阻断ATP合酶有关。由于E.coli对抗生素容易产生耐药性,故可尝试使用黄芩或其有效成分替代治疗。1.2不同抗sa药配伍的药养作用表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis,Se)是当前院内感染最常见的致病菌,也是假体等骨科内植物周围感染的主要致病菌。蒋献等研究了主要成分为黄芩浸膏的“一清胶囊”对Se和痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes,Pra)的体外抑菌作用。实验显示黄芩浸膏和胶囊对Se和Pra的MIC分别为1,0.98g·L-1。表明黄芩(“一清胶囊”的主要成分)对Se和Pra均有显著的抑菌效果。杨志强考察了黄芩等3种中药水煎剂具有体外抑制Se的作用。另外王坤等认为主要成分为黄芩的双黄连口服液对细菌生物膜的形成具有抑制效果。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,Sa)是人类的一种重要病原菌,是目前院内感染常见的革兰阳性菌,易引起化脓性感染。有报道1.25g·L-1的黄芩能100%抑制金黄色葡萄球菌。黄芩及其浸出液对Sa也有较好的抑菌作用,且黄芩对Sa的抑制作用强于痢疾杆菌,抗菌作用介于黄连与黄柏之间,为临床中药治疗痈肿疮毒和痢疾提供了实验依据。陈昌利等发现黄芩醇提物与蜂毒肽二者配伍可以显著的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),后者对所有与甲氧西林结构相同的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药。体外实验测得黄芩醇提物对MRSA的最大抑菌圈大于阳性对照;通过观察动物存活率和各脏器质量来衡量体内抑菌作用,结果表明黄芩醇提物和蜂毒肽配伍有较强的抑制MRSA作用。陈桂红等研究了中药黄芩、黄柏提取液及不同配伍体外抗MRSA的作用,实验中黄芩提取物对MRSA的MIC50为0.75g·L-1。另外发现,黄芩和黄柏以2∶1配伍对MRSA的MIC50为0.093g·L-1,具有协同抑菌效果。黄暨生等考察了含黄芩等3味中药的复方体内外抗MRSA的各组均明显降低小鼠的死亡率,延长小鼠的生存时间,结果为MRSA的治疗提供了实验依据。黄芩素在体外还可抑制Sa生物膜的形成,细菌生物膜的形成会大大降低其对抗生素的敏感性。杜仲业等通过构建Sa体外生物膜模型,发现黄芩素干预Sa可明显减少生物膜,机制或是黄芩素抑制Sa的黏附,进而抑制和杀灭Sa生物膜。黄芩素、黄芩苷不仅单用具有一定的抗菌作用,与抗生素联用时还能发挥协同效应。彭青观察到黄芩素与β-内酰胺类抗生素可协同抗MRSA,显著降低抗生素的MIC,增加Sa对抗生素的敏感性。推测机制或是黄芩素抑制MRSA耐药泵的基因表达,干扰自溶酶系统,阻碍相关DNA的复制和蛋白的合成。在陈勇川等的实验中,16mg·L-1的黄芩素可显著逆转MRSA对苯唑西林的高度耐药性,黄芩苷/黄芩素对MRSA产生青霉素结合蛋白(PBP2a)有明显抑制作用,表明黄芩苷/黄芩素或是通过抑制MRSA产生PBP2a来逆转对苯唑西林的耐药性。黄莹莹、Novy等分别观察到黄芩素与左氧氟沙星、土霉素、四环素也有协同抗Sa的作用。陈艳等通过构建体外Sa生物膜模型,发现亚抑菌浓度256mg·L-1的黄芩苷联合万古霉素可协同破坏建模3d的Sa生物膜,干预Sa生物膜的形成及发展。关于作用机制,云宝仪等认为黄芩素能影响Sa细胞膜的通透性、干扰菌体内蛋白质合成、抑制三羧酸循环和DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性。Krakauer等认为黄芩苷还可阻断相关信号通路来抑制葡萄糖球菌外毒素(一种超抗原)所诱导的炎性细胞因子释放从而降低Sa外毒素诱发的病理损害。1.3抗pa生物膜的作用铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)为院内感染重要的条件致病菌之一,当人体免疫力低下时更易感染,且病死率较高。文献报道黄芩和黄芩牡丹皮提取液对Pa有较强的抑制作用,且黄芩可增加Pa对氨苄西林和头孢他啶的敏感性,可与五倍子协同抗Pa。黄芩水煎液对Pa生物膜有较强的抑制和破坏作用。孔晋亮以PVC吸痰管为生物膜载体制作Pa体外生物膜模型,银染后SEM观察生物膜的形成情况,发现用药组几乎不形成生物膜。另观察黄芩、头孢他啶(CAZ)、左氧氟沙星(LFX)对早期生物膜和成熟生物膜的影响,显示黄芩能破坏Pa早期生物膜和成熟生物膜,且效果相当于红霉素组。另还发现黄芩能协同CAZ和LFX抑制、杀灭Pa。谭黎明认为黄芩提取物可以降低小鼠烫伤后感染Pa菌的死亡率,还可提高头孢他啶对Pa感染的疗效。黄芩素、黄芩苷等多种有效成分也具有抗Pa生物膜作用。王贵年等探讨了黄芩苷体外抗Pa生物膜的影响。黄芩苷对Pa4458,ATCC27853的MIC分别为15.65,32.25mg·L-1。黄芩苷干预体外构建Pa生物膜模型后,银染法观察到活菌数明显减少。谢林利等发现32mg·L-1的黄芩苷和2mg·L-1的黄芩素均可以影响Pa的黏附、抑制其形成生物膜,对早期生物膜形成的抑制作用强于对成熟生物膜的作用。Zeng等通过实验发现黄芩等在浓度为200μmol·L-1时可抑制Pa生物膜的形成,而黄芩素在20μmol·L-1时即可抑制Pa生物膜的形成,在4~40μmol·L-1时可促进大肠杆菌信号受体TraR蛋白水解。其另一项实验表明,200μmol·L-1的黄芩素与1g·L-1氨苄西林可表现出协同抗Pa作用。这些结果提示黄芩素的抗菌作用或涉及了Pa群感效应系统,有望开发成新型抗菌药。Brackman等发现黄芩苷在体内外能作为群感效应抑制剂(quorumsensinginhibitors,QSI)提高抗生素对细菌生物膜的抑制作用。针对体外构建的Pa生物膜模型,黄芩苷与妥布霉素(TOB)联用可以明显抑制其生物膜形成,但并不能增加突变菌株对TOB的敏感性。1.4对推进hp的作用幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡甚至胃癌等疾病的主要诱因。目前根除Hp的治疗是以抗生素为主的“三联”或“四联”疗法。文献报道黄芩、黄芩醇提物和黄芩苷体外有抗Hp活性,黄芩对Hp的MIC为3.9mg·L-1,黄芩苷和黄芩醇提物对Hp的MIC90分别为1.30,3.26g·L-1[40-41]。由黄芩等配伍的中药复方也具有较强的抗Hp作用。陆为民等在研究中发现,由黄芩等3味中药配伍的益气清热方能显著的抑制Ⅰ型Hp(Hp分为高毒力株Ⅰ型和低毒力株Ⅱ型)。体内实验表明益气清热方可以明显缓解Ⅰ型Hp感染后小鼠体重的下降,使胃系数降低。王小娟等研究的含黄芩等的中药复方灭幽汤能够改善胃黏膜炎症细胞浸润,抑制Hp的生长且有助于修复胃黏膜。采用HE染色法观察结果显示灭幽汤组Hp阳性率和胃黏膜炎症程度明显低于模型组和阳性对照组。ShiH等研究了三黄泻心汤(SHXT)及其主要组分黄芩苷对幽门螺杆菌感染胃上皮AGS(胃腺癌细胞)细胞的影响。结果表明SHXT(50,100,200mg·L-1)和黄芩苷(0.1,1,10μmol·L-1)虽然不影响Hp的生长曲线,但荧光定量PCR(RT-PCR)结果显示SHXT与黄芩苷可抑制AGS细胞IL-8和COX-2表达、IκBα的分解。其另一项实验显示SHXT和黄芩苷组可下调iNOSmRNA的表达,减少NO产生和p50的转移。王成喜等观察黄芩联合埃索美拉唑治疗Hp感染明显优于西药三联疗法,且可以机体增强免疫力,联合抑酸药可以清除Hp。在其后期研究中发现,黄芩、黄芪联合埃索美拉唑根除Hp有较好的效果,副作用小,提示中药黄芩具有潜在替代抗生素的价值。1.5黄爱芹、乙醇回流法提取的抗菌药效关系肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica,Se)是引起急性胃肠炎的主要病原菌,黄爱萍考察了黄芩水煮法和乙醇回流法提取的有效成分抗Se作用,发现黄芩乙醇回流提取液比水煮液抑菌作用强。Lu等也发现黄芩醇提物有抗菌作用。实验表明12.5g·L-1的黄芩醇提物对肠炎沙门菌表现出一定程度的抗菌或杀菌作用。1.6保肝作用的分离和诱导结核分枝杆菌(M.tuberculosis,Mtb)是引起结核病的病原菌。周清通过实验测得黄芩苷抗Mtb的MIC50和MIC90分别为6,12g·L-1。电镜观察黄芩苷作用Mtb细胞后,结核杆菌皱缩变形、菌壁消失、胞膜部分降解、胞质疏散、核糖体颗粒少、丝状DNA消失、电子密度降低。提示黄芩苷抑制Mtb的作用机制或是通过对细胞壁、细胞膜的破坏而达到抑菌作用。邝枣园等通过体外构建人脐静脉内皮细胞(ECV-304)模型探讨黄芩苷干预肺炎衣原体(CPN)感染细胞的机制。RT-PCR检测感染CPN的细胞无TLR4mRNA表达,TLR2表达较正常组提高,0.24g·L-1的黄芩苷干预感染CPN的细胞后TLR2表达下调。提示被CPN感染的ECV-304细胞可由TLR2介导应激,而黄芩苷可以抑制CPN所刺激TLR2的高表达。肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,Mp)可引起呼吸道疾病和全身性病变,是肺炎的常见病原体。孙艳平发现黄芩提取物对Mp的MIC为0.97~3.90g·L-1。该课题组还采用亚抑菌浓度的黄芩苷和大环内酯类药物体外诱导Mp,实验结果发现Mp菌株经黄芩苷诱导后不产生耐药性,而经红霉素、阿奇霉素诱导后均产生耐药和不同程度的交叉耐药。沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,Ct)可致失明、不孕症、异位妊娠和骨盆炎症等疾病。Hao等实验测得黄芩苷体外抗Ct的MIC50为0.50mmol·L-1。由于衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)参与降解宿主转录因子(RFX5),RT-PCR和Westernblot检测了RFX5,CPAFmRNA和衣原体感染细胞蛋白的表达,结果表明黄芩苷干预可上调RFX5表达,下调CPAF,提示CPAF或是黄芩苷作用的主要靶标。市售的熊胆黄芩滴眼液主要成分之一为黄芩苷,对沙眼及病毒性眼病有良好的治疗作用。肠球菌(Enterococcus)广泛存在与人和动物肠道,为院内感染的重要病原菌,由于其固有耐药和获得性耐药使得治疗更加困难。Chang等认为2~16mg·L-1的黄芩素与庆大霉素体外可以协同抗耐万古霉素的肠球菌。Time-kill实验结果显示32mg·L-1的黄芩素抑菌作用持续12h时,当浓度为64mg·L-1时抑制作用持续至36h。鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,Ab)为院内感染重要病原菌,可引起败血症、呼吸道感染等,随着Ab感染增多其耐药性也日益严重。Miyasaki等发现黄芩有效成分去甲汉黄芩素抗多耐药Ab的MIC为128mg·L-1,MBC为256mg·L-1。2黄从细胞培养、活性及混养剂的用量对ca有显著影响近年来念珠菌引起的真菌感染病例不断增多,在院内获得性感染中居第4位,其死亡率高达40%,尤以白念珠菌(Candidaalbicans,Ca)感染率最高。临床常用的抗真菌药物毒副作用大,且易产生耐药性,因而寻找抗真菌中药具有重要临床意义。黄芩及其不同提取物对Ca均有较好的抑菌效果,为临床治疗真菌深部感染提供了新的手段。有文献报道,黄芩乙醇提取液对耐氟康唑Ca标准株和都柏林念珠菌的MIC为7.8~15.6g·L-1。Wong等发现黄芩水提物对Ca12和ATCC28367的MIC分别为5,2.5g·L-1,且可抑制热带念珠菌。对于黄芩有效成分黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、野黄芩苷的抗菌活性检测,以黄芩素的白念珠菌抑制作用最强(MIC25mg·L-1)。黄芩素可诱导白念珠菌凋亡,协同氟康唑抗耐药白念珠菌。Huang等认为黄芩素能显著提高氟康唑的抗真菌作用(FICI=0.039)。黄杉探讨了黄芩素抗Ca的作用机制,实验发现1~2mg·L-1的黄芩素可有效抑制Ca,两药合用可使得耐氟康唑菌株变得敏感,表现为显著的协同作用。激光共聚焦显微镜(CLSM)观察提示黄芩素可抑制Ca生物膜的形成,机制可能是通过下调CSH1(细胞表面疏水性基因)的mRNA表达,降低细胞表面疏水性。流式细胞仪测得胞内活性氧(ROS)增加,线粒体膜电位(MMP)下降,或由黄芩素引起CAP1基因表达下调导致细胞凋亡。Dai等观察到4mg·L-1的黄芩素可使10%细胞凋亡,观察到染色质固缩、核碎裂,32mg·L-1黄芩素干预使得胞内ROS水平相对于对照组提高4倍,与氧化还原相关基因(CAP1,SOD2,TRR1)表达均有不同倍数的上调。Cao等研究发现16mg·L-1的黄芩素体外能显著抑制Ca的生物膜形成。正常的生物膜具有高疏水性(CSH)的特质,黄芩素能明显降低CSH。RT-PCR检测CSH1表达水平明显下降。Serpa等发现黄芩素抗6株念珠菌的MIC50为13~104mg·L-1,明显降低菌株活力。扫描电子显微镜(SEM)显示MIC50黄芩素干预酵母细胞,能抑制其产生丰富的细胞外基质和形成生物膜样结构。Lee等发现,黄芩素介导锰超氧化物歧化酶抗氧化应激,有保护线粒体作用。Kang等认为黄芩素对克鲁斯念珠菌(Candidakrusei,Ck)有抑制作用。实验测得黄芩素体外抗Ck的MIC为2.7mg·L-1。黄芩素可降低Ck细胞MMP。提示黄芩素抑菌机制或是通过干扰线粒体内稳达到抑菌效果。Fu等认为黄芩素与两性霉素B(AmB)能协同加速Ca凋亡。实验对30株临床菌株进行协同实验,发现FICI均值为0.053。二者联用细胞死亡89%,ROS水平为单用AmB的3倍。实时定量荧光PCR(qRT-PCR)显示黄芩素能显著提高半胱天冬酶活性和CaMCA1的表达。熊英等实验发现黄芩苷对Ca的MIC和最低杀菌浓度(MFC)为1.0~2.0g·L-1。另行同位素前体掺入试验,发现黄芩苷能明显的抑制[3H]-TdR,[3H]-UdR和[3H]-亮氨酸参入Ca,推测黄芩苷或是通过抑制Ca的基因、蛋白质生物合成来起到抑菌作用。张美玲等研究了甘肃黄芩的有效成分对Ca的抑制作用,结果显示黄芩素对Ca抑制作用强于黄芩苷。本课题组认为一定浓度的黄芩苷能有效抑制Ca芽管的形成及黏附性。实验发现100mg·L-1的黄芩苷对芽管抑制率与两性霉素B作用