四逆汤抗心肌缺血再灌注的线粒体氧化损伤作用及机制研究

四逆汤抗心肌缺血再灌注的线粒体氧化损伤作用及机制研究

在冠状动脉血管阻塞后，血液回流的中心心肌缺血。临床上，中心心肌缺血形成的再灌注损伤通常发生在血栓形成、血管形成、冠状动脉桥接合术和心脏移植术之后。许多研究结果表明活性氧自由基在心肌缺血-再灌注损伤的病理过程中起了重要的作用。由于心肌细胞中含大量的线粒体,因此心肌细胞线粒体呼吸链是病理状态下活性氧自由基产生的重要亚细胞器官,也就成为心肌缺血-再灌注损伤的重要原因。四逆汤是汉代张仲景在《伤寒杂病论》中所载主治少阴病的经典名方,由附子、干姜、甘草组成,具有温中祛寒、回阳救逆之功效。既往研究显示四逆汤具有良好的抗心肌缺血及再灌注损伤,全面保护心脏的作用。本文主要讨论自由基与心肌缺血-再灌注损伤及线粒体之间的关系,阐述四逆汤保护心肌缺血再灌注线粒体氧化损伤的作用机制。1材料和机器1.1实验材料附子、干姜、甘草,购自广州市药材公司。1.2实验动物雄性昆明种小鼠,体重(22±1)g,由中山大学中山医学院实验动物中心提供。1.3仪器、试剂和仪器垂体后叶素:上海第一生化药业公司上海生物化学制药厂;硫代巴比妥酸(TBA):SIGMA公司;蛋白定量试剂盒/乳酸检测试剂盒:南京建成生物工程研究所产品;10%磷钨酸:中山大学中山医学院设备科提供;TRIS:上海生物工程有限公司;四乙氧基丙烷:SIGMA公司;721分光光度计:上海第三分析仪器厂;5415R型高速低温台式离心机:德国Eppendorf公司;LXJ-Ⅱ离心沉淀机:上海医用仪器分析厂;PCR扩增仪为美国PERKINELMER公司产品;琼脂糖购于上海Yito企业有限公司;计算机凝胶成像仪为法国VL公司产品;Kontron图像分析仪为德国IBAS公司产品。引物是根据美国引物设计软件,利用鼠GENEBANK设计,由上海生物工程研究所合成。2小鼠心肌组织中ndmrna的检测2.1动物分组及处理将小鼠随机分为三组:对照组、缺血-再灌注模型组(简称模型组)、四逆汤治疗组(缺血-再灌注模型+四逆汤治疗,简称治疗组),每组8只。缺血再灌注模型采用腹腔注射垂体后叶素(Pit,30U/kg体重),注射Pit后20min缺血明显,80min再灌注损伤最为严重。对照组及模型组以蒸馏水灌胃,治疗组以四逆汤灌胃,连续3d,末次灌胃30min后治疗组及模型组腹腔注射Pit造模,80min后处死,取心肌组织放入液氮内速冻备用。2.2指标测定2.2.1心肌组织线粒体提取:将Tris1.21g及EDTA-2Na37.23mg加水500ml,用200mmol/LHCl滴定至pH=7.4后加入蔗糖3.42g、NaCl8g,再用蒸馏水补充至1000ml,放入盐水瓶中,以9磅压力进行消毒或微波消毒3~5min后放4℃冰箱备用。取各组小鼠心肌组织约100mg,加入0.9ml预冷的匀浆介质,冰上匀浆3~5min至未见组织颗粒。用普通离心机或低温离心机以1000r/min离心10min,取上清液以10000r/min(低温高速离心机)离心15min,沉淀为线粒体。将分离的线粒体用冰冻的匀浆介质制备成混悬液。2.2.2线粒体及组织SOD活力测定:取0.2ml线粒体悬液(蛋白浓度1mg/ml),4℃超声3min,将线粒体膜破碎,4000r/min离心15min,取上清备测;取心肌组织约100mg,加入预冷的生理盐水,冰上匀浆至无肉眼可见的组织颗粒,制备好10%的组织匀浆,4500r/min离心20min,上清液为SOD抽提液。用邻苯三酚自氧化法测定自氧化速率测定线粒体及组织SOD活力。2.2.3线粒体MDA含量测定:取0.25ml线粒体悬液(蛋白浓度1mg/ml),加入20%三氯醋酸(TCA)2ml振荡混匀,3000r/min离心10min,取上清1ml加入0.67%TBA1ml,沸水浴15min,室温冷却,在532nm波长处比色。2.2.4组织MDA含量测定:用硫代巴比妥酸(TBA)法测定。2.2.5线粒体肿胀程度测定:取0.25mg线粒体加入1ml含10-5mol/L硫酸亚铁的Tris-KCl缓冲液(50mmol/LTris,150mmol/LKCl,PH=7.4,新鲜配置)37℃水浴12min,于520nm波长处比色,4h后,再次测量各样品吸光度,以二者差值(A0min-A4h)表示线粒体肿胀程度。2.2.6组织中乳酸含量测定:使用乳酸检测试剂盒测定(蛋白定量采用考马斯亮兰法),具体操作按说明书进行。2.2.7基因表达检测:采用RT-PCR方法检测心肌组织MnSODmRNA的转录,计算各扩增产物灰度积分值(产物的面积×产物的平均灰度),结果以目的产物的灰度积分值/β-actin灰度积分值的比值表示。2.3统计学方法计量资料以x¯±sx¯±s表示。多组计量资料均数差别的比较运用单因素方差分析LSD法进行双侧检验,α为0.05。各统计资料均用SPSS11.0统计软件处理。3结果3.1da和乳酸含量结果如表1所示,与对照组相比,模型组心肌组织内SOD活性有所下降(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.01),乳酸含量升高(P<0.05)。与模型组相比四逆汤组心肌组织内SOD活性明显提高(P<0.01)、心肌组织内MDA及内乳酸含量明显降低(P<0.05或P<0.01),提示四逆汤能减少无氧酵解产生的乳酸,减轻组织氧化损伤。3.2od、mda活性、od活性的变化结果如表2所示,模型组线粒体内肿胀程度明显增加(P<0.01)、SOD的活性明显下降(P<0.01)、MDA含量明显升高(P<0.01)。而四逆汤可以明显减轻心肌缺血-再灌注损伤时线粒体肿胀程度,提高线粒体内SOD的活性,降低线粒体内MDA含量,减轻线粒体内氧化损伤。3.3两组之间比较结果如表3所示,模型组MnSODmRNA扩增产物与正常组比较有所减少,但是二者之间无显著差异(P>0.05);治疗组MnSODmRNA扩增产物明显增加(P<0.01),提示四逆汤可以上调缺血再灌注小鼠MnSOD基因的表达。4逆汤治疗冠心病心肌缺血的机制心血管疾病尤其是冠状动脉硬化性心脏病(冠心病)、心肌梗塞等缺血性心脏病对人类生命的威胁越来越大,预计到2020年病死率将占据首位。心肌缺血-再灌注损伤发生于冠状动脉血管阻塞后血液复流时,在临床上心肌缺血再灌注损伤过程的发生通常在如血栓溶栓术、血管成形术、冠状动脉搭桥术及心脏移植术后等试图恢复血流、减少缺血造成的心肌损伤的治疗后。目前研究认为心肌缺血-再灌注损伤的机制有以下几个相互作用或独立的方面:1)冠状动脉张力及管径的调节失衡;2)氧自由基产生过多;3)高能磷酸化合物不足;4)钙超载;5)酸中毒、无复流现象等。这几个方面相互联系,互为因果,共同促进了缺血-再灌注损伤的形成。中医认为冠心病之病机以心脾肾阳气虚衰为本,瘀血浊邪阻滞脉道为标,本虚标实。四逆汤是汉代张仲景在《伤寒杂病论》中的治疗少阴病的主方,由附子、干姜、甘草组成,方中附子回阳救逆,温肾暖脾;干姜温中散寒,回阳通脉、化痰滞;甘草和中益气,既缓附子、干姜之燥热,又助附、姜回阳救逆为佐。既往研究显示应用四逆汤治疗冠心病心肌缺血正契合病机,近十年来,本课题组对四逆汤的药理学作用及其机制进行深入广泛的探讨,结果发现四逆汤具有清除氧自由基、提高超氧化物歧化酶活性、改变血液粘度、扩张血管、改善能量代谢、抑制细胞凋亡的作用,四逆汤还具有良好的抗心肌缺血-再灌注损伤,全面保护心脏的作用[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15]。四逆汤的这种保护效应不但见诸于动物实验,而且在临床研究中也得到了证实:四逆汤对冠心病PTCA术后再灌注患者具有较好的清除脂质过氧化物、增加血循环中的NO水平、改善患者的生活质量。由此可见,四逆汤可以对导致心肌缺血及再灌注损伤的直接原因和间接原因进行多层次、多途径、多角度的干预,达到标本兼治的目的。本研究在以往四逆汤抗心肌缺血及再灌注损伤研究的的作用及机制的基础上,进一步探讨四逆汤抗心肌缺血-再灌注损伤的自由基-线粒体氧化损伤作用,以阐明四逆汤以线粒体为靶点治疗心肌缺血-再灌注损伤作用及其机制。氧化应激损伤在心肌缺血尤其是再灌注时起关键作用。机体在进行有氧代谢时可产生活性氧(ROS),在正常情况下,体内氧自由基的产生和清除是平衡的,当自由基的产生过多或体内抗氧化系统出现故障,体内氧自由基代谢就会出现失衡,自由基蓄积过多,攻击机体,即为氧化应激。线粒体介导的活性氧的产生对产生区域具有强大的破坏作用。由于活性氧自由基活性高、寿命短,因此它们主要攻击产生ROS附近区域,即线粒体。所以线粒体既是氧自由基产生的主要场所,也是氧化损伤攻击的主要部位,因此ROS可促进呼吸链的进一步损害,产生更多的ROS,形成恶性循环。MnSOD是线粒体内特异清除自由基的抗氧化酶,大多数羟过氧化物可被线粒体膜两侧CuZnSOD和MnSOD的通过GSHPx转化成水。因此,线粒体基质内MnSOD的含量直接决定了线粒体清除其自身产生的自由基的能力。由于线粒体膜的存在,外源性抗氧化物质无法对线粒体内氧自由基产生清除作用,因此只有提高线粒体自身抗氧化物酶MnSOD的活性,清除线粒体内氧化产物才能防止线粒体氧化损伤及进一步的恶性循环。本实验结果表明,四逆汤可以提高线粒体内SOD活性,降低线粒体MDA含量及线粒体肿胀程度,从而阻断线粒体内自由基