京尼平苷及其肠道代谢物京尼平在大鼠体内的药代动力学研究

京尼平苷及其肠道代谢物京尼平在大鼠体内的药代动力学研究

栀子是紫草科的一棵干燥、成熟的果实。经卫生部批准可用于医药和膳食。药用时,栀子常用作保肝利胆中药;在保健品中,常用于化学性肝损伤的辅助治疗。京尼平苷为栀子中的主要活性成分,且含量较高,大鼠灌胃给予280mg·kg-1的京尼平苷能导致严重的肝损伤。本实验观察了京尼平苷及其代谢物京尼平的药代动力学,为其安全、合理用药提供依据。1材料表面1.1药品理剂所需京尼平苷购自安徽亳州亚强天然产物制品厂,经HPLC峰面积归一法测定京尼平苷含量为98.5%;京尼平苷和芍药苷均购自中国药品生物制品检定所(批号分别为110749-200511,110736-200526);京尼平,经HPLC峰面积归一法测定京尼平含量不少于96.0%,β-葡萄糖苷酶(Fluka,productofSigma-Aldrich,Lot&Fillingcode:1076858,11505106)。1.2萃取小柱aglent地社会网Waters系列高效液相色谱仪系统,包括1515等度泵,2487型双波长紫外检测器,717自动进样系统,色谱数据软件Empower2software(USA);AccuBOND-C18固相萃取小柱100mg·mL-1(AgilentTechnologiesInc,USA);VenusilMP-C18色谱柱[4.6mm×150mm,5μm(AgelaTechnologiesInc,USA)];生物利用度研究数据处理通用程序BAPP2.0,中国药科大学药代中心开发。1.3动物SD大鼠,雄性,体重260～300g,由北京维通利华实验动物有限公司提供,动物合格证号:SCXK(京2002-0003)。2方法2.1苷酶的分离纯化参照文献方法制备,取1.0g京尼平苷和40mgβ-葡萄糖苷酶溶于20mL水中,在37℃的水浴中水解4h后取出,以乙醚萃取,合并乙醚液,无水硫酸钠脱水后,挥干乙醚,经乙醚重结晶后,在2.2条件下,按峰面积归一法计算,纯度为96.9%。2.2条件1流动相:甲醇-水-冰醋酸(35∶65∶0.2);柱温30℃;检测波长238nm;流速0.9mL·min-1,进样量5μL。2.3方法研究2.3.1对照品溶液的制备精密称取对照品京尼平苷、京尼平各1.87,2.97mg加甲醇溶解,稀释定容至50mL,分别制成37.4,59.4μg·mL-1的对照品溶液;精密称取内标物芍药苷2.16mg以高纯水溶解,稀释定容至25mL,即得86.4μg·mL-1的芍药苷内标溶液,备用。2.3.2线性回归的线性方程取一系列浓度的京尼平和京尼平苷对照品溶液用N2去掉溶剂加入空白血浆500μL,按2.5操作处理,计算相应对照品和内标物峰面积比值(Y),对应对照品的浓度X,经线性回归的直线方程如下:京尼平苷,Y=12883.57X-666.87(r=0.999);京尼平,Y=11955.07X-411.11(r=0.996);即京尼平苷浓度在93.5～1.87μg·mL-1线性关系良好;京尼平浓度在5.94～29.70ng·mL-1线性关系良好。京尼平苷和京尼平的检测限分别为7.6,5.5ng·mL-1。2.3.3返回率实验2.3.3.含药血浆的制备μg·mL-1的京尼平苷溶液300μL,N2吹干,精密加入空白血浆1.2mL混匀(9.35μg·mL-1),分别吸取含药血浆500,400,100μL,再加入空白血浆0,100,400μL,按照2.5操作处理。同样,取上述37.4μg·mL-1浓度的京尼平苷溶液加入甲醇按同样比例稀释,进样分析,京尼平苷高、中、低3个浓度平均加样回收率78.4%。2.3.3.加样回收率试验μg·mL-1的京尼平溶液100μL,N2吹干,精密加入空白血浆1.0mL混匀(5.94μg·mL-1),分别吸取含药血浆500,100μL,再加入空白血浆0,400μL,按照2.5操作处理,同样,取上述59.4μg·mL-1的京尼平溶液加入甲醇按同样比例稀释,进样,HPLC分析,京尼平高、低2个浓度的平均加样回收率98.6%。2.3.4空液压测定同一样品连续测定总法取上述同一样品连续重复进样5次测定,计算日内RSD=1.6%(京尼平苷)、2.3%(京尼平),第2～5天,取上述同一样品连续测定5次,计算日间RSD=2.9%(京尼平苷)、3.5%(京尼平)。2.4血浆药物浓度检测取雄性SD大鼠10只,随机分成2组,每组5只,实验前禁食14h,灌胃给予280mg·kg-1的京尼平苷溶液,第1组分别于给药后0.17,0.5,1.0,2.5,12.5h,第2组分别于给药后0.33,0.75,1.5,5.0,8.0h,眼眶取血1.5mL于肝素化的试管中,照2.5操作,记录各样品图谱,按内标法峰面积定量计算血浆药物浓度。2.5spe无固液分离经眼眶取血1.5mL于肝素化的试管中,轻轻混匀,10000r·min-1离心15min,分离血浆500μL,上样于已预处理好的SPE小柱,加入内标物溶液50μL;先用水1mL冲洗,再以甲醇500μL洗脱,收集甲醇洗脱液,0.2μm滤膜过滤,HPLC分析,内标法计算各自血浆药物浓度。3结果3.1减少京尼平苷、内标物、京尼平各峰的电导率测定经过预处理样品色谱图中内源性干扰成分大为减少,京尼平苷、内标物、京尼平各峰均达到基线分离,保留时间分别为6.39,7.93,10.70min,可见该方法专属性强。3.2药代动力学参数不同时间点的血药浓度,经BAPP统计拟合后,以AIC和R判断房室模型和选择参数,京尼平苷和京尼平均符合一室模型,在体内的平均滞留时间分别为2.4,7.9h,无明显蓄积现象,药代动力学参数见表1。4京尼平苷及其后血浆中栀子蓝的检测血药浓度经时数据经BAPP统计拟合后,京尼平苷和京尼平均符合一室模型。京尼平苷在血浆中代谢消除,单次给药经12.5h后京尼平苷血浆浓度仅为Cmax的2%,且消除速率常数为(0.75±0.24)h-1;京尼平达峰血药浓度很低,Cmax仅为(17.41±5.27)ng·mL-1。有文献报道京尼平苷引起的肝毒性与其在肠道转化成京尼平有关,但本研究发现京尼平血药浓度很低,且京尼平可以与甘氨酸结合而生成较强生物活性的栀子蓝,据此推测,栀子蓝可能为其导致肝毒性的直接物质基础。京尼平苷及代谢物组织分布与毒性的相关性研究尚在研究。本实验首次建立了内标法同时测定生物样品中京尼平苷及京尼平含量测定方法,选用性质较为近似的芍药苷作为内标物可以较好的消除样品处理过程中产生的误差,同时还可以克服生物样品回收率低的问题;文献采用外标法同时测定血浆中的京尼平苷及其京尼平,但是采