鸡蛋鸡蛋中溶菌酶含量和活力的测定

鸡蛋鸡蛋中溶菌酶含量和活力的测定

溶菌酶是一种能够通过分析细胞膜成分中的n-羟色胺和n-羟色胺-1.4糖苷键的酶。广泛应用于医药、食品工业、生物工程等领域。现在，从鸡蛋和蛋黄花中提取的溶菌酶达到了工业化生产水平。蛋清中的溶菌酶含量越高,酶活力越强,越有利于鸡蛋的保存,因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用,也为蛋品质评定提供了一个重要参数。对溶菌酶的研究始于20世纪初,英国细菌学家弗莱明在1922年发现人的鼻涕、唾液、眼泪有强大的溶菌活性,并把其溶菌作用的因子命名为溶菌酶。此后研究者在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在,其中鸡蛋蛋清的溶菌酶含量最高(约含0.3%)。鸡蛋蛋清已成为溶菌酶生产的主要原料,但是蛋清中溶菌酶的定量测定还没有一个较便捷的方法,传统的方法是先提取蛋清中的溶菌酶,再测定提取液中的蛋白含量。由于不可能完全提取出蛋清中的溶菌酶,这种方法计算出的蛋清溶菌酶含量往往比实际的数值小。溶菌酶活力的测定方法很多,目前,国内常用的有琼脂板扩散法、比色法、高效液相色谱法等,而国外多用比浊法测定溶菌酶活力。本研究在比浊法的基础上,针对鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量和活力设计出一套系统的测定方法,为蛋清中的溶菌酶测定提供一个标准方法,规范我国禽蛋中溶菌酶的测定。1材料和方法1.1溶壁微菌种m.lysodeimctus鸡蛋蛋清溶菌酶(20000U/mg)购自美国Sigma公司;溶壁微球菌(M.Lysodeikticus)购自中国科学院微生物研究所,菌种编号1.634;其他试剂均为分析纯级。1.2有关溶解酶含量的测定1.2.1标准曲线的绘制溶菌酶用0.9%氯化钠稀释成不同梯度浓度(0、0.2、0.4、0.8、1mg/mL),以溶菌酶工作液浓度为横坐标,281nm波长处吸光度为纵坐标绘制标准曲线,并求出回归方程。1.2.1浴5天时析蛋清用0.9%氯化钠稀释,乙酸调溶液至pH4.5,77℃水浴10min后取出,静置1h。离心取上清,按照标准曲线绘制的操作测得OD281值,由标准曲线回归方程计算蛋清溶液中溶菌酶的含量(C),再乘以稀释倍数即为蛋清中溶菌酶的含量(P)。1.3内酶活性测定1.3.1用0.2mol/ml代替产生的溶壁微生物1.3.2血清中每嫌犯总a、b将蛋清溶液、菌液于25℃水浴中保温,反应体系见表1。记下反应15s和75s时的读数A1、A2。按每分钟OD450值下降0.001为1个活力单位(U)的定义,蛋清中每毫克溶菌酶的活力用以下公式计算:式中,△E450为450nm波长处吸光度A1、A2之差;C为蛋清溶液中溶菌酶的含量(μg/mL)。1.4准确度、精度和开口1.5重复试验1.6伊萨蛋和京海黄蛋中的溶菌酶测定1.7统计分析用软件SPSS11.0统计各指标均值和方差,并运用GLM程序的方差分析对伊萨鸡蛋和京海黄鸡蛋蛋清溶菌酶含量和活力进行比较。2结果与分析2.1溶菌酶标准曲线溶菌酶溶解后经紫外-可见分光光度计检测,在281nm波长处出现峰值。配制不同梯度浓度溶菌酶溶液,每毫升溶液中的溶菌酶含量与281nm波长处吸光度呈线性关系,标准曲线图形见图1,标准曲线回归方程为Y=2.4429X+0.0149,R2=0.9998。2.2综合密度、精度和灵敏度的结果2.2.1血清中溶菌酶含量测定精密度一般用相对标准差RSD(即变异系数CV)表示,RSD越低,则表示方法精密度越好。低、中、高3种浓度(3种浓度蛋清溶液是依据稀释倍数不同,本研究低浓度蛋清稀释了70倍,中浓度蛋清稀释了20倍,高浓度蛋清稀释了10倍)的蛋清溶液中溶菌酶含量的日内(上午、下午和晚上)和日间(不同日的同一时间)测定结果见表2和表3,其中日内RSD<3%(2.01%、2.08%、0.80%),日间RSD<4%(3.18%、2.36%、1.46%),3种浓度蛋清溶液的溶菌酶含量测定值日内RSD均小于日间RSD。2.2.2溶菌酶测定m通过已知量溶菌酶标准品在蛋清溶液中的加样回收试验,用溶菌酶的回收率(R=(M-P)/A×100%其中,M为测得溶菌酶量;M-P为回收溶菌酶量)表示方法的准确度,回收率越接近100%,表示方法准确度越高。以蛋清溶液(由1.2测得P为197.35μg/mL)为溶剂配制200、400、600μg/mL溶菌酶溶液,添加回收率计算结果见表4,3种浓度溶菌酶的添加回收率都在95%以上。2.2.3测定溶菌酶含量的定量限灵敏度用最低定量浓度(定量限LOQ)和最低检测浓度(检测限LOD)2项指标表示。配制一系列低溶菌酶浓度溶液,对每种浓度取样4次进行测定,定量限测定结果见表5,当酶浓度降低到4μg/mL时,相对误差E>20%,因此本方法测定溶菌酶含量的定量限为5μg/mL。以蛋清溶液为溶剂配制一系列低浓度的溶菌酶溶液,蛋清溶液为空白调零,检测限测定结果见表6,当溶菌酶浓度低于0.3μg/mL时,吸光度值不稳定,因此本方法测定溶菌酶含量的检测限为0.3μg/mL。2.3溶菌酶测定结果测定方法是否稳定用重复样的相对标准差来表示,RSD越小,测定结果越一致,证明测定方法越稳定。蛋清重复样1~5的溶菌酶含量和活力测定结果见表7。重复样的溶菌酶含量RSD为3.03%,活力RSD为6.17%,即本方法所测蛋清溶菌酶含量和活力的RSD都小于7%。2.4蛋清溶菌酶活力2个品种鸡蛋蛋清溶菌酶含量和活力的测定结果见表8。本试验所测伊萨鸡蛋和京海黄鸡蛋蛋清溶菌酶平均含量分别为3.47、3.71mg/mL,蛋清溶菌酶平均活力分别为16183.74、15689.35U/mg。伊萨鸡蛋较重(P<0.01),蛋清溶菌酶含量显著低于京海黄鸡蛋蛋清溶菌酶含量(P<0.05);伊萨鸡蛋蛋清溶菌酶活力略高于京海黄鸡蛋蛋清溶菌酶活力,(P>0.05)。3讨论3.1溶菌酶的提取途径测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶含量的传统途径是先提取再测定,从蛋清中分离纯化溶菌酶已有不少报道,虽然正交试验的酶回收率可达94%,但是再精确的提取途径也无法完全提取出蛋清中的溶菌酶。本方法测定蛋清中的溶菌酶含量精密度(RSD<4%)、准确度(R>95%)、灵敏度(LOQ5μg/mL,LOD0.3μg/mL)、可重复性(RSD<7%)均符合方法评估实验要求,所测2个品种鸡蛋蛋清溶菌酶含量(2.93~4.07mg/mL)与相关研究结果基本一致,且本方法测定过程不涉及提取,测定周期短,对酶的活力影响小。3.2s至65s的时间酶的活力表示为特定条件下单位时间内转化底物的速度,试验过程中,每5s记录1次测定管的吸光度值,在15s至75s之间测定管吸光度值以稳定速度下降,因此单位时间选择为15s至75s,该时间段的选择在文献中亦有描述。2个品种鸡蛋蛋清溶菌酶活力测定结果(13832.54~20842.74U/mg)与以往研究一致。溶菌酶活力的测定方法很多,其中比浊法是一直沿用至今的经典方法,本方法借鉴了前人在比浊法上的研究成果,改进酶活力的测定条件,缩短了测定时间(1min),运用本方法大批量、不定时测定蛋清中的溶菌酶活力时,为了节省每次测定培养溶壁微球菌的时间,可以把培养好的溶壁微球菌用20%的甘油作为保护剂,放入冰箱-20℃下保存,每次测定时称取少许菌和甘油的混合物制成底物即可使用。4消溶酶活力测定方法本方法用紫外-可见分光光度计,在不需要提取溶菌酶的情况下直接测定蛋清中的溶菌酶含量,测定周期短,对酶活力影响小,方法稳定可靠;改进了经典比浊法酶活力的测定条件,缩短了测定时间,尤其在大批量、不定时测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶活力时,减少测定成本。本研究为家禽蛋清中溶菌酶的测定提供了一套操作性强、易于掌握、结果可靠稳定的方法,本测定鸡蛋蛋