利用反复冻融法和超声波技术破碎啤酒酵母细胞壁

利用反复冻融法和超声波技术破碎啤酒酵母细胞壁

近年来，中国的啤酒工业迅速发展，成为世界最大的啤酒产量。2012年，啤酒产量达到49万hl，占世界产量的1.4%。该行业的迅猛发展带来了大量的废弃酵母,啤酒酵母中含有大量的营养物质,50%左右的蛋白质,23%~28%碳水化合物,6%~8%核糖,2%B族维生素,1%谷胱甘肽以及丰富的氨基酸、矿物质,对酵母进行破碎,是综合利用酵母的一种有效途径。酵母细胞壁较厚,难以破碎,目前破碎酵母细胞的方法主要有酶法破壁、化学法破壁、物理法破壁。酶法酶制剂较贵,酶解时间长;化学法对蛋白质的损伤较大,容易引起蛋白质变性;单一的物理方法(如微珠法、反复冻融法、高压匀浆法、超声波法)破壁效率低、能耗大。反复冻融法是较温和的破壁方法,可以避免高温对原料造成的营养损失、风味裂变等不良影响。超声波破碎是一种有效的、温和的破碎细胞的方法,由于超声引起空穴,液体会形成小气泡,在气泡发生空穴的破碎期间,大量声能转化成机械能,引起剪切梯度使细胞发生破裂,目前已广泛应用于微生物和植物细胞中核酸、蛋白质的提取。啤酒酵母细胞壁厚难以破碎,要有效利用细胞中的营养成分必须对其进行破壁处理,本研究以破壁率为指标,首次采用反复冻融法与超声破碎法协同破碎酵母细胞,旨在提高酵母的破壁率,为进一步综合利用酵母细胞提供参考依据。1材料和方法1.1仪器、试剂与仪器啤酒酵母,实验室保藏;葡萄糖,国药集团化学试剂有限公司;酵母膏,国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨,国药集团化学试剂有限公司。冷冻离心机,CR21GⅡ;超净工作台,苏净安泰二级生物安全柜BHC-1000ⅡA2;生物光学显微镜,GalenⅢ;超声细胞粉碎仪,南京新辰生物科技有限公司;激光粒度分析仪,美国Microtrac公司S3500;恒温恒湿培养箱,SPX-150C型;电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司AL104;pH计DELTA320,上海分析仪器三厂;血球计数板,XB-K-25血细胞计数板;高压蒸汽灭菌锅,YXQ-LS-SⅡ。1.2方法1.2.1扩大培养条件将酵母菌活化,接种于YPD液体培养基中,在30℃、130r/min的培养箱中进行扩大培养20h,冷冻离心,灭菌去离子水洗涤3次,离心取沉淀备用。1.2.2重复冷冻法中断壁参数的选择以酵母细胞的破壁率为指标,考察加水量和冻融次数对破壁效果的影响。1.2.2.反复冻融3次设计7个处理,分别喷加5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%的无菌去离子水,慢速冷冻2h,解冻1h,如此反复冻融3次。每个处理重复3次。1.2.2.破壁率的影响因素处理为喷加25%的无菌去离子水,分别冻融1、2、3、4、5、6次,冻结2h,解冻1h,每个处理重复3次。设定超声辐射时间间隔为15s,于冰浴中对酵母细胞进行超声破碎。以破壁率为指标,考察超声功率、超声总时间、每次辐射时间、酵母浓度等因素对破壁效果的影响。先进行单因素实验,找出这4个因素的影响规律和优化范围。由于当功率达到500、600W时,超声产生的热效应很明显,有部分细胞发生炭化沉于底部,所以单因素试验的超声功率取400W、超声总时间取15min、每次辐射时间取10s、酵母浓度取20mg/mL。为了得到酵母细胞破壁率与4因素之间的量化关系,在单因素试验基础上,以酵母细胞破壁率为考察指标,以L9(34)正交表进行4因素3水平的正交试验。正交设计见表1。1.2.3酵母细胞的破壁率将反复冻融与超声波破碎技术相结合,比较单独作用与协同作用条件下酵母细胞的破壁率。协同作用条件:加水量25%,慢速冷冻2h、解冻1h,反复冻融4次,超声功率400W,每次辐射时间11s,超声总时间14.5min,酵母浓度20mg/mL。1.2.4酵母细胞的破碎前后数量采用活菌显微镜直接计数法,参照郭卫芸等人处理方法进行活菌计数。其中,α为酵母细胞的破壁率;M为破壁前的酵母菌细胞数;N为破壁后的酵母菌细胞数。1.2.5关于母乳喂养的形态的观察采用日立S-4800扫描电子显微镜(SEM)进行观察。测试样品参照孙镇平等人的高倍扫描预处理改进方法进行处理。1.2.6母因子粒度检测利用激光粒度分析仪对破碎前后的酵母溶液进行粒度分布测试。1.2.7数据分析数据统计采用SPSS17.0进行单因素方差分析及LSD多重检验(P<0.05),数值以均值±标准差表示。2结果与分析2.1重复冷冻法对母细胞破壁率的影响2.1.1酵母细胞破壁率结果由图1可以看出酵母细胞的破壁率随着加水量的增大呈现先增大后平缓的趋势。在加水量为25%时破壁率达到了29.25%,加水量大于25%时,破壁率变化很小,可见加水量为25%时酵母细胞间隙几乎被水分填充满,使得反复冻融对酵母细胞的机械破坏作用几乎达到最大。这与郭卫芸等人有关文献报道相比稍有提高,可能与酵母菌种、冻融解冻速度条件有关。2.1.2反复冻融破壁率由图2可以看出,酵母细胞的破壁率随着冻融次数的增加而增加。冻融次数低于2次时,破壁率较小,增加不是很明显,这可能是由于破壁率小不易观察。当反复冻融超过3次时,破壁率超过了30%,这可能由于冰晶的反复作用使得细胞破裂容易观察。当冻融4次以后,破壁率增加趋于平缓。2.2超声场对母细胞破壁率的影响2.2.1超声功率对酵母细胞破壁的影响超声功率和频率是影响超声场强度的主要因素,当频率不变,功率较低时超声依靠机械效应和稳态空化效应使传质边界层减薄,一定程度上使粒子运动加速,超声功率增加时超声在液体中的作用主要是通过激烈而短暂的瞬态空化效应完成的,高强度超声产生的空化效应比低强度超声时强得多,因此,功率越大超声破碎程度越大。由图3可以看出,随着超声功率的增大,酵母细胞的破壁率先增加后趋于平缓。当功率达到500、600W时,超声产生的热效应很明显,有部分细胞发生炭化沉于底部,因此选用的超声功率为400W。2.2.2超声时间的影响由图4可以看出,随着超声总时间的延长,酵母细胞的破壁率逐渐增加。这主要是由于能量具有累积效应,随着超声时间的延长,超声稳流振荡及空化效应积累越多,有利于酵母细胞的破碎。然而,能量的不断积累,可引起超声波的化学效应,即能量能将溶出的大分子打断或使其变性,所以并非时间越长越好。综合考虑,选取超声的总时间为15min。2.2.3超声空化效应测定由图5可看出,酵母细胞的破壁率随着每次超声辐射时间的增加呈现先增加后基本不变的趋势,当每次辐射时间达到10s时,破壁率达到最大,此后基本不变。超声波的空化效应需要一定的时间来完成,每次辐射时间较短,超声空化时的机械效应较低,细胞壁破坏较少;当辐射时间达到10s时,空化效应产生的机械作用使得酵母细胞细胞壁破裂。2.2.4不同浓度菌体破壁率随菌体浓度的变化情况由图6可以看出,随着菌体浓度的增加酵母细胞的破壁率呈现先增大后减小的趋势。在浓度为20mg/mL时破壁率达到61.45%,此后随着菌体浓度的增大,破壁率逐渐减小。由此可以推测,合理的酵母细胞浓度可以有效提高超声破壁的效率,选取菌体浓度为20mg/mL。2.2.5影响酵母细胞破壁效果的因素正交试验结果如表2所示,以表3的方差分析为依据,选取超声总时间作为误差估计项,研究结果表明,B(超声功率)和D(酵母菌浓度)对酵母细胞的破壁效果有显著影响(P<0.05)。由极差分析可以看出影响酵母菌破壁效果的各种因素的主次关系为B(功率)>D(菌体浓度)>A(每次辐射时间)>C(超声总时间)。正交试验结果结合K值可知最佳破壁条件为B2D2A3C1,即超声功率400W,每次辐射时间11s,超声总时间14.5min,酵母浓度20mg/mL。2.3超声波法和高压均质法破壁率的研究由表4可看出,利用反复冻融与超声破碎协同作用可使酵母细胞的破壁率达到89.31%,是反复冻融4次单独作用的2.4倍,是超声破碎单独作用的1.5倍。刘晓永等人的研究表明,研磨法的破壁率只有10.03%,超声波法对酿酒酵母的破壁率只有76.36%,不能满足研究的需要,珠磨机法的破壁效果良好,但设备需进口,较为昂贵。孙海翔等人的研究表明,高压均质法和高速分散法的破壁率在50%~70%。反复冻融与超声波协同作用破碎酵母细胞操作简单、破壁率高,综合比较发现协同作用是破碎酵母细胞的一种高效的方法。2.4放大倍数为5.200k采用扫描电子显微镜(SEM)对破壁前后的酵母菌形态进行观察,放大倍数为5.00K时的图像如图7所示。从图7可以看出,破壁前酵母菌的形态比较完好,呈现颗粒状的形态,经过破壁处理后大部分酵母菌细胞破裂,形态结构被破坏,呈现碎片的形态。2.5反复冻融法破碎酵母的浓度由图8可以看出3种方法处理前后酵母溶液的粒度分布的变化情况。破壁前酵母溶液的粒度分布如图a所示,该啤酒酵母的粒度分布比较窄,其中d0.1=4.3μm,d0.5=5.59μm,d0.9=9.45μm。反复冻融处理后酵母溶液的粒度分布如图b所示,经冻融后酵母溶液中约1/3的酵母破碎,小颗粒的溶度有所增加,溶液颗粒分布变宽,其中d0.1=0.076μm,d0.5=2.713μm,d0.9=4.47μm。超声破碎后酵母溶液粒度分布如图c所示,与b图相比小颗粒的浓度更大,说明破壁率比反复冻融的高,约3/5的酵母破碎,破碎后的颗粒更小,其中d0.1=0.049μm,d0.5=2.144μm,d0.9=4.21μm。反复冻融和超声破碎协同处理后酵母溶液的粒度分布如图d所示,超过4/5的酵母细胞被破碎,与其他2种处理方法相比,破壁后溶液中的小颗粒分布更宽,其中d0.1=0.01310μm,d0.5=0.02500μm,d0.9=3.67μm,说明绝大多数的酵母破壁成为碎片,协同处理破碎酵母的效率更高。3反复冻融和超声协同处理情况反复冻融和超声破碎协同作用是破碎啤酒酵母细胞的一种高效、温和的处理的方法,该法能够保持大分子物质的活性,为进一步综合利用啤酒废酵母提供了参考。通过