盐胁迫下ca2+对蚕豆气孔运动及质膜k

盐胁迫下ca2+对蚕豆气孔运动及质膜k

土壤盐分限制了作物的种植面积和产量，严重影响了农业生产。近20%的农业面积和50%的耕地处于盐势严重的两难境地。盐胁迫最大的危害是可利用水的亏缺,气孔作为植物体水分散失的门户,其开与关对植物抵抗盐胁迫起着重要作用。早期研究发现,外源NaCl处理可诱导植物气孔运动。其中,Na+可以通过高亲和K+转运体(highaffinityK+transporter,HKT)和低亲和阳离子转运体(lowaffinitycationtransporter,LCT)以及非选择性阳离子通道(NSC)进入细胞。但迄今为止,有关Na+对保卫细胞的调控机制还不甚清楚。Ca2+已被广泛认为是胞内信使,参与ABA、H2O2诱导的气孔关闭。诸多生物及非生物胁迫都会引起植物胞质Ca2+浓度([Ca2+]cyt)的上升,植物可以根据[Ca2+]cyt变化的差异如位置、幅度、频率及持续的时间解码不同的刺激,从而使细胞做出不同的反应。研究发现胞外Ca2+可引起保卫细胞[Ca2+]cyt振荡诱导气孔关闭。胞外Ca2+浓度([Ca2+]ext)增加可引起[Ca2+]cyt上升,增强盐忍耐。最近,研究酵母发现胞外Ca2+通过Cch1pandMid1p-Ca2+运输体系进入细胞提高[Ca2+]cyt,而拟南芥中胞外Ca2+可能作为一种信号通过与质膜Ca2+受体CAS结合,激活磷脂酶C(PLC),增加IP3浓度,诱导胞内钙库释放Ca2+以提高[Ca2+]cyt。然而胞外Ca2+如何进入植物保卫细胞还不甚了解。另外,已有研究表明[Ca2+]cyt的上升,可通过降低Na+的吸收,有效地控制Na+/K+在植物中选择性积累,增加其对NaCl胁迫的抗性。尽管如此,胞外Ca2+缓解盐胁迫机理以及对保卫细胞质膜相关离子通道如何调节并不十分清楚。我们的研究发现,H2O2可通过对保卫细胞质膜K+通道及胞内pH的调节介导ABA诱导的气孔关闭,也可通过诱导质膜H+-ATPase脱磷酸化介导ABA抑制蓝光诱导的气孔开放。Yan等报道H2O2也可介导ABA抑制的气孔开放,Pei等报道H2O2可以激活保卫细胞质膜Ca2+通道,促使Ca2+内流。那么,胞外Ca2+缓解盐胁迫,抑制气孔开放是否有H2O2的参与则不清楚本研究针对上述问题,利用药理学、电生理学及细胞生物学的研究技术和方法,探讨外源Ca2+在NaCl胁迫条件下对保卫细胞质膜K+离子通道的调控机制,以期明确外源Ca2+对NaCl胁迫的缓解机理,为改善盐渍土上的农业生产提供理论依据。1材料和方法1.1培养土营养土质将蚕豆(ViciafabaL.)种子用75%乙醇表面消毒5min,在生化培养箱中催芽3～4d,播种于培养土(营养土∶蛭石为2∶1)中。蚕豆生长的光/暗周期为12h/12h,光照强度为0.20～0.30mmolm-2s-1,昼夜温度分别为25℃±2℃和20℃±2℃,相对湿度在70%左右,生长期间无胁迫。1.2lyasey-33、二氯荧光素二乙酸酯及2dcf-da纤维素酶(CellulaseRS)购自日本YakultHonsha公司;果胶酶(PectolyaseY-23)购自日本SeishinPharmaceutical公司;二氯荧光素二乙酸酯(dichlorofluorescindiacetate,H2DCF-DA)购自Sigma公司,使用前配成50mmolL-1DMSO溶液,分成小包装冷冻保存;其他试剂均为分析纯。1.3气孔关闭试验参见Zhang等方法,取3～4周龄蚕豆苗顶端第1～2对完全展开的叶片,用蒸馏水洗净,撕取下表皮,洗去叶肉细胞后,切成5mm长的表皮条,暗处理2h诱导气孔关闭。用CO2-free10mmolL-1MES50mmolL-1KCl(pH6.15)开放缓冲液为对照,以缓冲液中加入NaCl和不同浓度的CaCl2为处理,同时在23℃下,光照(0.20～0.30mmolm-2s-1)2h。然后在10×25倍倒置显微镜下用测微尺测定气孔宽长比值。每个处理至少用3个表皮条,每个表皮条随机测20个气孔开度,每个处理重复5次(不少于300个气孔开度),统计平均值和标准误差。1.4流、分离、流、压的检测分离原生质体参照Zhang等的方法,取3～4周龄苗顶端第2对完全展开叶,用蒸馏水洗净,撕取下表皮,洗净叶肉细胞后,切成约5mm长的表皮条,进行酶解提取。酶解液含1.3%纤维素酶RS、0.0075%果胶酶(PectolyaseY-23)、0.25%牛血清蛋白(BSA)、0.5mmolL-1抗坏血酸,用山梨醇调渗透压至460mOsmolkg-1,pH5.5(KOH)。记录质膜K+电流采用Hamill等常规全细胞记录技术。非NaCl胁迫下所用细胞外液含10mmolL-1谷氨酸钾、2mmolL-1MgCl2、1mmolL-1KOH、10mmolL-1Mes;NaCl胁迫处理细胞外液含100mmolL-1NaCl、谷氨酸钾10mmolL-1、2mmolL-1MgCl2、1mmolL-1KOH、10mmolL-1Mes,用山梨醇调渗透压至460mOsmolkg-1,并调至pH5.5(KOH)。NaCl胁迫及非胁迫下电极液均包含100mmolL-1谷氨酸钾、2mmolL-1MgCl2、4mmolL-1KOH、1.1mmolL-1MgATP、0.1mmolL-1CaCl2、10mmolL-1Hepes,山梨醇调渗透压为510mOsmolkg-1,pH7.2(KOH)。刺激电压从–190mV逐级去极化到+110mV,每级为+20mV,维持时间3s,频率为0.2Hz。全细胞封接形成10～15min后采集数据,以连续两次稳定的值作为对照电流,不同浓度Ca2+处理10min后采集处理数据。使用EPC-9膜片钳放大器(HEKAElektronik,Lambrecht,Germany)测定全细胞电流,使用PULSE+PULSEFIT软件采集和分析全细胞电流,每一试验结果重复6～8次。1.5细胞荧光分析参见Lü等的方法,事先取出表皮条,在5mL负载缓冲液(10mmolL-1Tris,50mmolL-1KCl,pH7.2)中培养,然后将H2O2荧光探针加入盛有表皮条的负载缓冲液中混均,使H2DCF-DA终浓度为50μmolL-1,负载温度控制在25℃,负载时间15min。然后将负载H2DCFDA的表皮条用新鲜负载缓冲液漂洗两次,以洗去细胞表层多余的探针,然后用盖玻片迅速将表皮条固定在显微镜载物台上,用激光共聚焦扫描显微镜(FV1000,Olympus)观察。LCSM的工作条件为:Ex=488nm,Em=500～550nm,Power2%,Zoom3～5,中速扫描,Frame512×512pixel;对每个细胞荧光变化做适时记录。每个实验至少重复5次,当结果一致时,取其中一个细胞用FV10ASW1.6该软件用于分析荧光强度2结果与分析2.1胞外ca2+对nacl诱导气孔开度的影响图1所示,100mmolL-1NaCl处理可明显促进气孔开放,其增加值为35.6%,等浓度KCl代替NaCl处理具有类似的效应。低浓度的胞外Ca2+(0.1mmolL-1CaCl2)可促进NaCl诱导的气孔开放,较高浓度的胞外Ca2+处理可有效抑制NaCl诱导的气孔开放,其中10mmolL-1CaCl2处理可使NaCl诱导的气孔开度下降39.0%,显著抑制NaCl诱导的气孔开放。另外,非NaCl胁迫下10mmolL-1CaCl2胞外处理几乎完全抑制气孔开放。2.2盐胁迫对质膜k+通道的影响非盐胁迫下,低的[Ca2+]ext(0.1mmolL-1CaCl2)处理对保卫细胞质膜内向K+及外向K+通道基本没有影响,而较高的[Ca2+]ext(10mmolL-1CaCl2)处理几乎完全抑制保卫细胞质膜内向K+通道电流显著激活其外向K+通道电流,1mmolL-1LaCl3的加入并不能缓解上述效应(图2)。在100mmolL-1NaCl胁迫条件下,0.1mmolL-1CaCl2显著激活保卫细胞质膜外向K+通道,对内向K+通道影响甚微,然而10mmolL-1CaCl2处理能显著抑制保卫细胞质膜外向及内向K+通道,1mmolL-1LaCl3的加入能很好地缓解盐胁迫下高的[Ca2+]ext处理对质膜内向及外向K+通道电流的抑制作用。表明在盐胁迫下胞外Ca2+可能主要通过质膜Ca2+通道进入胞内,进而调控质膜K+通道(图3)。为了进一步比较胞外Ca2+对质膜K+通道的调控机制,选择同一电压下质膜K+通道电流的变化进行比较。100mmolL-1NaCl能抑制保卫细胞质膜内向K+通道,抑制K+电流55.3%(图4-A),但对质膜外向K+通道活性影响不大(图4-B)。较低的[Ca2+]ext(0.1mmolL-1CaCl2)对胁迫与非胁迫下的保卫细胞质膜内向K+通道有轻微的促进作用(图4-A),却能显著增加盐胁迫下质膜外向K+通道电流,其增加值为140%(图4-B)。较高的[Ca2+]ext(10mmolL-1CaCl2)能明显抑制胁迫及非胁迫下质膜内向K+通道电流(图4-A),且增加非胁迫下质膜外向K+通道电流,其增加值为148%(图4-B)。与上面分析结果类似,1mmolL-1LaCl3能缓解较高的[Ca2+]ext对盐胁迫下质膜K+通道的抑制(图4-A)。2.3s1nacl胁迫对财务细胞h2的诱导用H2O2专一的荧光探针二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)标记蚕豆保卫细胞来检测胞内H2O2的水平变化。结果显示,100mmolL-1NaCl胁迫下,10mmolL-1Ca2+处理表皮条2min后即可诱导保卫细胞中H2O2产生,处理10min后能显著诱导H2O2在保卫细胞中积累。单独使用100mmolL-1NaCl或10mmolL-1Ca2+以及100mmolL-1NaCl+0.1mmolL-1Ca2+等处理均不能明显诱导H2O2积累(图5)。3胞外ca2+对质膜k+通道的影响在盐胁迫条件下,植物调整合适的气孔开度以防止水分的过度散失,并确保二氧化碳的吸收以保证光合作用的进行,这对植物的生长发育是至关重要的。本试验对蚕豆表皮生物学分析显示,100mmolL-1NaCl处理可明显促进气孔开放(图1),而等浓度KCl代替NaCl处理具有类似的效应。说明高的胞外K+和Na+胁迫均可以加强K+和Na+向胞内的运输,以诱导气孔开放。Schachtman等报道Na+可以通过内向K+通道与K+竞争进入细胞,也可以通过外向K+通道进入细胞,从而改变保卫细胞的渗透势,迫使气孔开放。由图4可知,100mmolL-1NaCl处理可以部分降低K+的内向通道电流,并不影响其外向K+通道电流,说明Na+可能与K+竞争通过内向K+通道进入细胞,但Véry等报道Na+并不通过内向K+通道与K+竞争进入细胞,而是通过外向K+通道进入细胞。无论K+和Na+以怎样的机制进入保卫细胞,NaCl胁迫条件下气孔开放对植物来说都极其不利。Ca2+作为胞内重要第二信使,调控植物诸多生长发育及胁迫应答过程。非盐胁迫下,较高浓度的胞外Ca2+可以诱导气孔关闭(图1),这与McAinsh等的研究结果一致。本研究发现,高的[Ca2+]ext几乎完全抑制质膜内向K+通道,并激活外向K+通道(图2),这与Schroeder等报道[Ca2+]cyt升高可以抑制内向K+通道、激活外向K+通道结果相似。因此推测,胞外Ca2+可能是通过引起[Ca2+]cyt升高以发挥其对质膜K+通道的调节功能。Tang等和Epstein等报道拟南芥中胞外Ca2+可作为一种信号,与其质膜受体CAS结合,通过IP3信号转导途径,诱导胞内钙库释放Ca2+以提高[Ca2+]cyt。胞外Ca2+有没有可能通过质膜Ca2+通道直接进入胞内提高[Ca2+]cyt?为证实这一点,在胞外液中加入1mmolL-1LaCl3,如图2所示,LaCl3的加入并不能缓解高的[Ca2+]ext对质膜K+通道的调控作用,因此基本上排除了非盐胁迫下胞外Ca2+通过质膜Ca2+通道直接进入胞内的可能。在NaCl胁迫条件下,高浓度CaCl2处理也可显著抑制NaCl胁迫诱导的气孔开放(图1),而且较高的胞外Ca2+能同时抑制质膜内向及外向K+通道,该现象可以被1mmolL-1LaCl3缓解(图3),表明在盐胁迫条件下,[Ca2+]ext可能主要通过质膜Ca2+通道进入细胞,以提高[Ca2+]cyt,从而阻止K+内流,防止Na+通过质膜K+通道进入细胞(图3,图4),又可促进Na+跨质膜外流,进而抑制NaCl胁迫诱导的气孔开放(图1),这将极大地提高NaCl胁迫下植物的保水能力。值得注意的是,10mmolL-1CaCl2胞外处理,对盐胁迫和非盐胁迫下质膜K+通道有着并不完全相同的调控结果(图4)。产生该现象的可能原因是在这两种情况下胞外Ca2+进入胞内的方式存在差异,造成[Ca2+]cyt振荡存在诸如位置、幅度、频率及持续时间等的不同,导致植物对这些差异产生不同解码,最终做出不同的反应。另外,相同条件下,不同浓度胞外Ca2+可能通过影响[Ca2+]cyt振