花椒挥发油抑菌效果的测定

花椒挥发油抑菌效果的测定

青椒是指稍微干燥、成熟的蔬菜果实，如洋香科植物青椒（zalovumenzhangyun）和zecc（zecc）。该属植物全世界约有250种,我国有50种变种,主产区为中国、日本及朝鲜。花椒既是一种香料,同时又是一种很好的药物。花椒的果皮、种子、枝、叶等均可入药,因此,花椒的各个部分都有很好的利用价值。我国的华北、华中、华南均有分布,河南省伏牛山、太行山栽培较为集中,鄢陵各处均有栽植。我国的花椒产量较大,年产量在2000万t以上。《中华人民共和国药典》中规定花椒为传统中药记载它有“温中止痛,杀虫止痒”的功效。花椒还有抑菌、抑制血小板凝集、抗氧化等多种作用。据有关报道,花椒的提取物或挥发油在抗病毒、杀病菌和微生物等方面有显著功效。特别的是对酵母菌和霉菌有明显的抑菌效果。与化学合成的抑菌剂相比,天然产物抑菌作用更为安全。为了更好地开发这一天然抑菌剂,本实验选用大红袍花椒和梅花椒两个品种作为实验材料,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、面包酵母、青霉、黑曲霉作为供试菌种;对花椒挥发油的抑菌效果进行研究。1材料和方法1.1培养基和细菌大红袍花椒市售,产自我国陕西,具有穗大粒多、皮厚肉丰、色泽鲜艳、香味浓郁、麻味适中、油重、麻香兼优等特点;梅花椒市售,产自我国四川;具有粒大色红、口味香麻醇、肉厚无杂质、品质绿色等特点。大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、面包酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉(Penicilliumsp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)均由中南民族大学工商学院环境与生物工程实验中心提供。牛肉膏蛋白胨培养基(细菌用):牛肉膏3g;蛋白胨10g;琼脂15~20g;NaCl5g;水1000ml;pH7.2~7.5。豆芽汁培养基(霉菌和酵母菌用):黄豆芽100g;葡萄糖(酵母菌用)或蔗糖(霉菌用)20g;琼脂15~20g;水1000ml;自然pH值。1.2冰柜、标准曲线及问题101-2AB型电热鼓风干燥箱;10~100μl、1000μl、5000μl微量可调移液器;SC-3297A型冰柜;85-1型磁力搅拌器;SW-CJ-2D型超净工作台;YXQ-LS-50SⅡ全自动立式压力蒸气灭菌器;SPX-1008-0恒温振荡培养箱。1.3方法1.3.1花椒提取物的蒸馏参照文献、的方法,将两个品种花椒分别用小型电动粉碎机粉碎,两种花椒粉末各取30g分别放入两只100ml烧杯中,用冷水浸泡12h。将浸泡过的花椒粉末置于接有水蒸气蒸馏装置的圆底烧瓶中,放入少量冷水并加入沸石。用电炉加热3h。收集100ml馏出液后,停止蒸馏。用乙醚萃取馏出液,收集上层液体,置于50℃左右的水浴中,将乙醚蒸出,最后得约8~10滴的淡黄色并且强烈辛辣芳香气味的油状物,即为花椒的有效成分——花椒挥发油。1.3.2青椒挥发油抗抗菌作用研究1.3.2.菌的污染特性本实验所采用的菌种,在日常生活中都是较为常见的。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,主要寄生在大肠内,致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行。同时也是水源和食品被污染强度的指标。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在,空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到,并且是人类化脓感染中最常见的病原菌,可引起局部化脓感染。啤酒酵母和面包酵母在食品制作中有重要作用,但有些酵母菌对生物或用具是有害的,例如红酵母(Rhodotorula)会生长在浴帘等潮湿的家具上。青霉和黑曲霉等霉菌会引起水果、蔬菜等食品的腐烂。1.3.2.菌种活化方法参照文献、方法制备菌悬液。菌种的活化:将实验所用菌种接种在新鲜的斜面培养基上进行活化,细菌37℃下培养24h,酵母28℃下培养48h,霉菌28℃下培养48~72h。活化后的菌种用无菌水制成菌悬液。将各菌悬液用无菌水分别稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66个浓度梯度的溶液。1.3.2.浓度梯度法确定花椒挥发油的浓度将1.3.1节方法得到约0.4~0.5ml的花椒挥发油,利用二倍稀释法,采用95%乙醇作为溶剂,将其稀释成2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%浓度梯度的溶液。1.3.2.花椒挥发油菌种的培养利用平板涂布法进行最低抑菌浓度(MIC值)的测定。在已灭菌了的培养皿中倒入适量培养基,从已经稀释过的菌悬液中各取100μl加入到已经冷却凝固的培养基上,用灭过菌的涂布棒将菌液涂布均匀。分别从不同梯度浓度的花椒挥发油溶液中取100μl放入加有菌悬液的培养皿中,用涂布棒涂布均匀。将培养皿做好标记,于培养箱中培养,培养温度和时间分别为:细菌37℃培养24h,酵母菌28℃培养48h,霉菌28℃培养72h。观察各个培养皿中菌的生长情况及记录菌落数量。以完全没有菌生长的最低浓度为提取物溶液的最低抑菌浓度(MIC)。1.3.2.生长情况的测定采用滤纸片扩散法。用打孔器将滤纸制作成直径为5.5mm的小圆纸片,将小圆片滤纸贴于已涂布菌悬液的牛肉膏、蛋白胨固体培养基上,分别取各花椒挥发油溶液50μl滴到每张小圆纸片上,用95%乙醇作为对照,于培养箱中,细菌37℃培养24h,酵母菌28℃培养28h,霉菌28℃培养72h。观察菌的生长情况并进行数据的记录。测量抑菌圈的直径,重复3次。2结果与分析2.1发酵苯氧基的抑制作用滤纸片法测定结果见表1、2。从表1、2可见,花椒挥发油对啤酒酵母、面包酵母、青霉、黑曲霉有明显的抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌也有抑制作用,但是其抑制作用相对较弱一些;两个品种花椒挥发油的抑菌情况相比较,可以看出花梅椒挥发油的抑菌效果比大红袍花椒挥发油强。2.2对各抗菌药物的最小抑菌浓度上述各供试菌种每系列浓度2次重复实验,观察结果见表3、4。由表3、4可见:大红袍花椒挥发油对细菌最小抑菌浓度>2%;对啤酒酵母的最小抑菌浓度为2%;对面包酵母和霉菌最小抑菌浓度≥2%。梅花椒对细菌最小抑菌浓度>2%;对酵母菌和黑曲霉的最小抑菌浓度≥2%;对青霉的最小抑菌浓度为2%。3花椒的抑菌作用两种花椒挥发油对实验所用的酵母菌、霉菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球