苦瓜水提物和山梨酸钾对几种食品污染微生物的抑菌活性比较

苦瓜水提物和山梨酸钾对几种食品污染微生物的抑菌活性比较

食品保藏期的延长和食品品质的保证起着非常重要的作用。腐烂保鲜剂是食品工业中最重要的食品添加剂之一。传统的食品防腐保鲜剂主要是化学合成品,由于合成防腐保鲜剂可能存在毒性和致癌的问题,在许多国家已被逐步禁止或限制使用。国际上食品添加剂朝无毒、安全、天然方向发展已形成趋势。因此,评价和筛选具有抑菌防腐活性的天然资源已发展成为食品行业研究的新领域。苦瓜是一种食药两用的天然植物,是常用蔬菜之一,具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、提高机体免疫力能力、抑菌等多种生物活性。已有研究表明,苦瓜提取液对11种165株革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌和革兰阴性杆菌具有抑菌抑菌作用,并且对肉类食品具有抑菌防腐作用,说明苦瓜是一种良好的天然广谱抑菌剂。但现有对苦瓜抑菌的研究多集中在乙醇提取物方面,由于苦瓜乙醇提取物在水中的溶解度较低,限制了它在食品工业中的应用范围。鉴于此,本文研究了苦瓜水提物的抑菌作用,并与常用食品防腐剂山梨酸钾的抑菌效果进行对比,以探讨苦瓜水提物作为食品天然防腐剂的应用前景。1材料和方法1.1受试菌种sq基层苦瓜粉:实验室自制,以市售新鲜苦瓜(为同一品种的油瓜类苦瓜)作为原料,洗净,用切片机将其切成均匀的薄片,50℃烘干,粉碎,过40目筛,干燥保存。山梨酸钾:市售食品添加剂。细菌菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),大肠杆菌(Escherichiacoli),沙门氏菌(Salmonellasp.);霉菌:黑曲霉(Aspergillusniger),米曲霉(Aaperiyillusoryzae);酵母:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),黏红酵母(Rhodotorulaglutinnis)。上述受试菌种购于广东省微生物研究所。牛肉膏蛋白胨培养基(细菌用)、马铃薯培养基(霉菌、酵母用):按照文献配制。1.2实验仪器与仪器EB-330H分析天平:SHIMADZU;HH-S数显水浴锅:上海锦屏仪器仪表有限公司;EYELA旋转蒸发仪:日本;LDZX-405AI立式自动电热压力蒸气灭菌器:上海申安医疗器械厂;LRH-150-Ⅱ型生化培养箱:广东省医疗器械厂;SW-CJ-1F超净工作台:上海阳光实验仪器有限公司;UV-1700紫外-可见扫描仪:SHIMADZU。1.3实验方法1.3.1苦瓜水提物的制备称取苦瓜干粉,以1∶30的质量比例加入蒸馏水,60℃水浴回流提取2次,每次4h,合并滤液,于旋转蒸发仪上浓缩,真空冷冻干燥,得到苦瓜水提物,于冰箱中4℃保存备用。称取适量苦瓜水提物以无菌蒸馏水分别配制成20、40、60、80mg/mL浓度的水溶液备用。1.3.2菌种培养和培养将所有供测试的菌种移接入相应的试管斜面培养,每种接多支重复。细菌置37℃恒温培养箱培养24h;酵母、霉菌置30℃恒温培养箱培养48h。将上述活化好的各种菌分别挑取一环制成初试菌悬液,取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀释成含菌量为1.0×108cfu/mL的菌悬液备用。1.3.2抑菌圈测定用无菌吸管吸取上述各种菌悬液0.1mL于无菌平皿中,然后倒入15mL已冷却至45℃经高压灭菌后相应的培养基,充分混匀后水平放置,制成含菌平板。用无菌镊子将灭菌后直径5mm的小圆滤纸片置入苦瓜水提物样品液中,浸泡0.5h后取出,贴于平板上,每个纸片相隔一定间距,每种菌各设3个重复,以常用食品防腐剂浓度20mg/mL的山梨酸钾水溶液和无菌水作为对比和对照,放入培养箱中,37℃下细菌培养24h,霉菌30℃下培养48h。按时取出,测定抑菌圈直径,取其平均值为测定结果。以上操作均在超净工作台上完成。判定标准:以抑菌圈直径大于5mm者评价为有抑菌作用,无菌水对照组应无抑菌圈产生,否则实验无效。无菌水对照组所测直径为滤纸片直径。1.3.3菌种生长测定121℃湿热灭菌30min。用试管二倍递减稀释法将苦瓜提取物配制成600、300、150、75、37.5、18.75、9.375mg/mL浓度的苦瓜水提物系列培养基,每一系列接种一种菌,每个浓度做3个重复。以常用防腐剂山梨酸钾作对比,并以无菌水作对照,置于培养箱中,细菌在37℃下培养24h,霉菌、酵母30℃下培养48h。观察生长现象。另取一稀释系列,不接任何菌作为空白对照。将培养后的培养物与空白对照在紫外-可见扫描仪上进行比色测定,以二者光吸收值基本相同,即培养基中没有菌生长的最低浓度作为苦瓜水提物的最低抑菌浓度。2结果与分析2.1苦瓜水提物的抑菌效果通过测定不同浓度苦瓜水提物样品抑菌圈的直径来评价其对受试食品常见污染微生物的抑制状况。结果如表1所示。从表1可以看出,苦瓜提取物对受试细菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有较好的抑制效果,当苦瓜水提物浓度为20mg/mL时就有明显的抑菌现象,均强于同等条件下相同浓度的食品防腐剂山梨酸钾溶液;而且水提物浓度与抑菌圈之间具有量效关系,抑菌圈直径随水提物浓度增加而扩大。表1的结果也表明,苦瓜水提物对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的抑制作用尤为显著:浓度为40mg/mL时抑菌圈直径均超过10mm、浓度为80mg/mL时抑菌圈直径均在14mm以上,提示苦瓜水提物在用于预防细菌性食物中毒方面具有开发前景。此外,表1的结果表明苦瓜水提物对黑曲霉、米曲霉等受试霉菌和啤酒酵母、黏红酵母等受试酵母的抑制效果不明显,仅在浓度达到60mg/mL或者80mg/mL时才出现很小的抑菌圈,直径均不超过5.5mm;而食品防腐剂山梨酸钾则对上述微生物具有良好的抑制作用,浓度为20mg/mL时即产生相当明显的抑制效果,抑菌圈直径均达到10mm以上。2.2最低抑菌浓度采用比浊法测定苦瓜水提物对各供试微生物的最低抑菌浓度。培养后的培养物与空白对照在紫外-可见扫描仪上进行比色测定结果见表2。由表2可见,当苦瓜提取物及山梨酸钾增加到一定浓度时,培养物与空白对照吸光度基本相同,即此浓度下培养物中无菌生长,可确定该浓度为苦瓜提取物及山梨酸钾的最低抑菌浓度,最低抑菌浓度分析结果见表3。表3的研究结果进一步证实了苦瓜水提物对受试菌中细菌的抑制作用远远大于霉菌和酵母:对大肠杆菌的MIC为37.5mg/mL,对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的MIC达到18.75mg/mL;对黑曲霉和米曲霉的MIC为300mg/mL,对啤酒酵母和黏红酵母的MIC为600mg/mL。山梨酸钾则对受试酵母和霉菌的抑制效果显著强于苦瓜水提物,对受试细菌的抑制效果远远低于苦瓜水提物。这一研究结果与前述滤纸片法的测定结果相吻合。3苦瓜水提物的抑菌活性成分已有研究表明,苦瓜对革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌和革兰阴性杆菌具有较好的抑制效果。本实验证明了苦瓜水提物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等受试细菌具有良好的抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌具有显著抑制效果,说明苦瓜水提物在预防细菌性食物中毒方面具有应用前景。已有研究表明,许多植物提取物对霉菌和酵母的抑制作用较弱或没有抑制作用,本实验也表明了类似的研究结果,即苦瓜水提物对受试米曲霉和黑曲霉以及啤酒酵母和黏红酵母显示了较弱的抑制作用,可能因为粗提物中含有利于霉菌和酵母生长的化学成分,削弱了抑菌活性成分对霉菌和酵母的抑制作用,如果将抑菌活性成分分离纯化,则有可能增强其对霉菌和酵母的抑制效果。关于苦瓜水提物抑菌活性成分的确定及其分离纯化尚有待进一步探讨。以往的研究表明,山梨酸钾对霉菌和酵母的抑制作用强于其对细菌的抑制作用,本研究的结果表明,在实验范围内,山梨酸钾对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等受试细菌的抑制作用远低于苦瓜水提物,而对受试米曲霉和黑曲霉以及啤酒酵母和黏红酵母的抑制效果良好,远强于苦瓜水提物。因此,在开发新型食品防腐剂时,可以考虑将苦瓜水提物和山梨酸钾进行复配,达到既提