表面等离子体共振技术在微量生物和化学活性物质测定中的应用

表面等离子体共振技术在微量生物和化学活性物质测定中的应用

传感器是将生物或化学等物理变量转换为实用、存储和处理的物理电源的变换装置，在长寿、化学、环境科学等领域发挥着非常重要的作用。目前应用较为广泛的为光学和电学传感器。光化学传感器中的光纤传感器与电学传感器相比,具有信号不受电磁干扰、不需参比传感器、可以加工成各种尺寸、易于实现远距离遥测等优点,日益受到相关领域尤其是生物医学学科的科技工作者的青睐。光纤表面等离子体传感器是将高灵敏度的表面等离子体传感技术与低能量消耗的光纤传输技术有机结合的产物。它能够对传感器表面待测介质组成的微小变化作出灵敏的响应,适用于研究传感器表面敏感层中物质与介质溶液的生物及化学反应,进而定量测定介质溶液中的微量生物和化学活性物质。1993年Jorgenson等人提出了两种基于光纤的表面等离子体(SPR)传感装置,使得光纤表面等离子体传感技术得以实际应用。目前该技术在化学、生物、环境及医药等领域已展现出了广阔的应用前景。1金属薄膜镀后金属膜表面等离子体共振的测量存在于金属或半导体表面的自由电子的行为类似于自由电子气,当这些表面自由电子与特定的电磁波相互作用时,将吸收电磁波的能量,从而产生表面等离子体共振。光线从光密介质向光疏介质传播时,若入射角大于临界角,则在两种介质的界面处将发生全内反射。但是,光波的电磁场强度在界面处并不立即减小为零,而是部分地进入到光疏介质中,随入射深度以指数形式衰减,形成所谓的消逝波,消逝波的有效深度一般为100～200nm。因消逝波的存在,光线在界面处的全内反射将产生一个位移。若光疏介质很纯净,在没有吸收和其它消耗的情况下,则消逝波沿光疏介质表面传播约半个波长,再返回光密介质,全内反射强度并不会被衰减。将一层高反射的金属薄膜镀在玻璃或石英支持体上,当光以一定的入射角透过支持体照射到金属薄膜的表面并发生全反射时,由于金属膜的厚度(约50nm)小于消逝波的深度,在金属与溶液或空气的界面处,消逝波仍起作用,其在X轴方向的分量(见图1)为:Kev=ωcε0−−√sinθ(1)Κev=ωcε0sinθ(1)式中:ω是入射光的角频率;ε0是支持体的介电常数;θ是入射光的入射角;c是光速。同时,在金属和溶液或空气的界面处,金属表面的自由电子气将被激发,产生振荡电荷,从而形成表面等离子体激元:Ksp≈ωcε1ε2ε1+ε2−−−−√(2)Κsp≈ωcε1ε2ε1+ε2(2)式中:ε1是金属膜的介电常数;ε2是金属膜表面样品的介电常数;其它项同式(1)。当Ksp和Kev相等时,金属表面的等离子体激元将与消逝波发生耦合,产生表面等离子体共振吸收,反射光强度急剧下降,达最小。此时的入射角θsp称共振角。入射光中,只有p偏振光能激发表面等离子体共振。Ksp=Kev(3)Κsp=Κev(3)此时:sinθsp=f(ω,ε0,ε1,ε2)(4)sinθsp=f(ω,ε0,ε1,ε2)(4)在实际测量时,往往利用金属膜表面的样品的折射率来替代其介电常数,以入射光的波长λ替代角频率ω,且ε0和ε1为常量,故式(4)可用下式描述。sinθsp=f(λ,n)(5)sinθsp=f(λ,n)(5)式中:λ为入射光波长;n为金属膜表面样品的折射率。而样品的折射率又与样品中待测化学或生物量(m)的大小有关,故有:sinθsp=f(λ,m)(6)sinθsp=f(λ,m)(6)由于消逝波的有效深度仅100～200nm,表面等离子体共振所测得的化学或生物量m仅是金属表面很短距离内的值,而非其本体值,因此SPR是研究表面作用的一种很有效的手段。SPR测量所用的支持体通常是棱镜,测量装置见图2。金属薄膜材料通常是金或银,金属薄膜表面的敏感层是一种能与待测物相互作用的化学或生物敏感膜,以将化学或生物量转化为可用SPR技术测量的折光率变化量,实现对化学及生物量的测定。2光纤表面等离子体传感装置的发展随着光纤制作和传输技术特别是光纤传感技术及光纤器件的发展,光纤在化学及生物医学传感领域得到了广泛应用。光纤作为光通信的远距离光传输介质,传输过程中,耦合进入的光在纤芯和包层界面发生全内反射,因此在长距离传输过程中,光损耗较小。全内反射传输光的纤芯,正好可以作为SPR测量的金属薄膜支持体,在纤芯的表面镀上一层金属膜,光纤就可以作为SPR测量的敏感器件。自Jorgenson等人提出了基于光纤的SPR传感装置之后,光纤表面等离子体传感器在化学、生物学、环境科学以及医学领域的文献报道逐年增多。有两种形式的光纤表面等离子体传感装置。一种是终端反射式,另一种是在线传输式。其结构见图3。在线传输式光纤SPR传感装置是将光纤中间一段的外层剥去,在纤芯上沉积一层高反射率的金属膜。在纤芯内进行全反射传输的光,与金属膜相互作用,满足条件的光将会产生表面等离子体共振吸收。在光纤的出口端检测输出光强度与波长的关系,进行定量分析。终端反射式光纤SPR传感装置的构造方法是,在光纤的一端沉积一层厚度达300nm的金属膜,作微反射镜。将此端一段长5mm左右的光纤包层剥去,并在纤芯上沉积50nm左右的一层金属膜。在光线传输过程中,满足条件的光将在被金属膜微反射镜反射前后,经过两次共振,而返回的光传输到光纤光谱仪进行检测。对于光纤SPR传感器,也可以采用和普通棱镜耦合式SPR传感装置类似的角度调制、波长调制和强度调制法进行测量。光纤传感器可以直接用纤芯上沉积的金属薄膜做敏感器件。但为了扩大光纤SPR的应用范围,和普通SPR传感器一样,通常再在金属薄膜上沉积上一层化学或生物敏感膜。光纤SPR传感器敏感元件所使用的光纤,通常是单模光纤。单模光纤可以保持激发光的偏振态;只耦合单一反射角的光进入光纤传输,能得到反射背景较小的尖锐峰形的SPR共振峰。而多模光纤,由于模式的耦合、偏振态的损失,与棱镜耦合式SPR相比,只能得到宽而低的峰。3光纤spr传感器检测原理在将金属镀膜在纤芯上之前,需将光纤外包层剥去,并用合适的溶剂清洗纤芯表面。通常采用真空蒸发镀膜的方法在纤芯表面沉积上一层金膜或银膜,并经高温退火处理。为了使SPR共振峰出现在可测量的波长范围内,有时还需要在纤芯表面首先真空蒸发沉积上一层铬膜,并在金或银膜表面再用合适的方法沉积上一层氧化物膜(通常是SiOx),但这样做将降低敏感层的敏感度。Meriaudeau等制作了一种在线传输式光纤SPR传感装置。具体方法如下:将一段光纤剥去塑料外保护层,用48%的HF处理2h,仔细用蒸馏水、丙酮、乙醇和异丙醇清洗。之后,用电子束(electron-beam)真空蒸发系统,在石英晶体厚度监测器(quartz-crystalthicknessmonitor)控制下,在纤芯上镀上一层40nm的金膜,并在200℃温度下退火处理4min。测量时,将样品倾注在光纤上,并完全覆盖敏感区域,光源(高压Xe灯)发出的光,经单色器分光后,用微透镜耦合进光纤一端,光纤的另一端用光电二极管记录下400～900nm区间的透射光强度。为减少光在金属薄膜区域的泄漏损失,他们又在单层膜的基础上,制作了多层金属薄膜,其中的每一层均采用真空镀膜的方法进行,且每一层镀膜之后均采用各自的退火工艺处理。Obando等考察了不同形状的终端反射式光纤SPR传感器的性能。他们将末端0.5cm的多模光纤保护层剥去,抛光成不同的锥面,用溅射镀膜法沉积上一层1nm的Cr、50nm的Au,镀膜时,用QCM控制膜厚。整个传感装置,采用一50W的全光谱QTH光源,反射光经光谱仪分光后,以CCD检测器,通过在-38℃的低温下检测。采集的数据,经计算机进行比较和累加,并用多元回归方法处理。Diez等制作了一种在线式光纤SPR传感器。他们将单模光纤中间一部分的外保护层去掉,用特定的方法拉制成细腰形(长几厘米),并在该部分纤芯的外表面上镀上一层金膜。以此光纤为敏感元件,白光光源(卤素灯),光谱仪检测透射光光谱,可进行波长和强度调制检测。Slavik等使用一种特殊的方法制作光纤SPR传感器敏感膜:将单模光纤的保护层去掉,将其固定在一个刻有弧形凹槽的硅块上的凹槽内,用胶将其固定;将硅块的一边打磨,使光纤侧面被打磨至接近纤芯部位;真空镀膜法镀上一层金膜,若需要可在金膜上下沉积上其它物质的薄膜。以半导体激光器作光源、光纤线圈偏振控制器(fiber-coilpolarizationcontroller)调整偏振状态,硅光电二极管为检测器,对样品进行测量。LinWenBin等将多模阶跃光纤的表面沉积上一层金膜作为SPR的敏感元件,对生物样品进行分析。同时,他们又在多模阶跃光纤表面用真空蒸发镀膜技术镀上一层银膜,再在银膜表面用Sol-gel技术沉积一层ZrO2(18nm)。用激光光源产生670nm的平面偏振光,光电二极管检测,角度调制法研究其SPR。为保护银膜不被氧化,应在银膜表面采用自组装技术沉积上一层硫醇。4应用领域各应用领域分为7个主要应用领域和应用场景光纤SPR的应用研究目前仍处于起步阶段,生命科学和化学是它的两个主要的应用领域。通过建立SPR信号和样品折光率之间的关系,光纤SPR传感器被用于测定样品折射率的变化,进而对引起折射率变化的溶液浓度、敏感层与溶液中特定物质间的生物和化学作用进行研究。4.1动态线性范围和动态调感技术溶液折射率测定是光纤表面等离子体传感器最基本的应用,是对其它应用性数据进行测定的依据。由于光纤表面等离子体共振传感器敏感膜的不同,其折射率测定的动态线性范围也在1.3～1.7之间变化,动态线性范围较宽时,测定灵敏度较低。折射率变化的检测灵敏度随敏感膜和光纤调制方式的变化而不同。Slavik等人研制的光纤SPR传感器,采用强度调制技术,折光率在1.328～1.338之间可以测定低达4×10-5的折射率变化;采用波长调制技术,在1.3302～1.3422折射率区间能够测定5×10-5的折射率变化。Meriaudeau制作的光纤SPR传感器折射率测定的动态线性范围很宽(折射率1.3～1.7),但灵敏度较低,采用波长调制技术,使用可以分辨0.01nm波长变化的高分辨光谱仪,折射率变化的测定灵敏度为8.8×10-5折射率单位。4.2抗体-抗原相互作用由于生物大分子在光纤SPR传感器表面的相互作用,能够引起折射率的较大变化,因此光纤SPR传感器是生物免疫分析强有力的测试工具。Quinn等将光纤SPR用于生物传感领域,研究抗体-抗原的相互作用,并用于测定血液中特定抗体。结果表明,虽然光纤SPR传感器背景噪音较普通SPR传感器大,但由于其小巧、价廉,仍是生物组织中大分子物质含量测定的合适工具。LinWenBin等研究了硫醇在光纤SPR传感器金表面的吸附行为,同时利用抗体-抗原的相互作用,采用强度调制技术,对兔免疫球蛋白进行测定,