金属薄膜表面的spr研究

金属薄膜表面的spr研究

1其它信息的计算spr技术可以获得与金属膜表面之间的光学常数相对应的金属膜表面，而该介质中的其他信息是spr研究的主要目标。例如通过膜厚估计成膜物质的结构排列,通过介质的折射率(n)、膜厚度(d)和吸收系数(k)计算吸附物质的质量,进而求得相互作用的生物大分子之间的键参数。一般而言,SPR传感器主要用于测定物质的质量和动力学常数。1.1物质的量的计算方法在k=0的条件下,SPR的信号(共振波长或共振角的变化)与介质的n和d有关,而n和d与被测物质的量(浓度)有关。此处先讨论n和d与被测物质量的关系。但是,由于所分析的样品一般很复杂,其基体很难准确知道,故这里仅能给出一些大概的思路。介质的n直接与介质的质量密度ρ及物质的性质有关,这些参数之间有下述最基本的关系式中,M代表分子量;N代表单位体积物质的摩尔数;A代表物质的摩尔折射率;ρ反应了所研究物质的量。A实际上反应了物质的性质,它是物质本身的属性,在一般情况下随条件的变化较小。例如,当空气的压力由1.00个大气压增大到176个大气压时,A仅由4.606变为4.772;O2由气体变成液体时,A仅由4.05变为4.00;水由气体变成液体时,A由3.72变为3.71。由两种或两种以上物质组成的混合物,其单位体积的物质摩尔数之和为而混合物单位体积摩尔折射率A等于各物质单位摩尔折射率的平均值,即同样,混合物的分子量M等于各物质分子量的平均值,即将(2)、(3)、(4)式代入(1)式可得对于多原子分子,分子的Am由各原子的摩尔折射率Aa组成式中n分别代表分子中所含原子的个数。对于吸附在SPR传感器表面膜厚为d(单位nm)的纯物质,其吸附的质量m(μg/cm2)可用下式计算若吸附的介质为混合物(在实际应用中SPR研究的对象基本都是混合物),则上式将变成较为复杂的形式。此时可将所有介质的折射率集合为一个体系的折射率,如式(5)所示。例如,假定混合物是一个理想状态,即由两种物质构成,一种为折射率为n的蛋白质,另一种为折射率为nb的缓冲液,则在厚度为d的混合膜层中,吸附的蛋白质质量为方程(8)可用于计算折射率小于1.5而大于nb的薄膜的吸附质量。若薄膜的折射率大于1.5,则不太适用。实际上,人们一般均根据实验曲线计算物质的浓度和质量,而很少使用这些复杂的公式。1.2kts-4吸附td反应算法SPR传感技术主要应用于研究生物大分子之间的相互作用,得到反应物分子之间每一步的键合信息,测定动力学常数。其最显著的特点是可实时监测反应的动态过程,而不需要对反应物进行标记。此处仅用SPR最经常研究的抗原-抗体免疫反应体系作为典型代表,进行最简单的反应动力学分析。在抗原-抗体反应过程中,一般首先将抗体X固定在传感器表面,然后将含抗原L的溶液引入样品池,抗原分子可立即与抗体分子的特异键位点结合,吸附速率常数为ka(单位是L·mol-1·s-1)。在结合过程中,一些能量较高的抗原分子可能克服抗原-抗体分子之间的作用力,而脱离传感器表面进入液相,此过程为脱附或称解吸,解吸速率常数为kd(其单位是s-1)。当吸附与解吸达到动态平衡时,传感器表面会吸附一定数量相对稳定的抗原分子。此时的吸附可以看成是单分子层吸附。运用Langmuir吸附模型,假定表面吸附力场均匀,吸附分子之间的作用力很小,则吸附平衡常数为其准一级反应的速率方程为式中,[L]为溶液中抗原的浓度,可忽略已结合到传感器表面的少量抗原,视[L]为一固定值;[X]tot为传感器表面吸附抗原分子达到饱和时的抗体浓度,为表面的总键合能力。[XL]为形成的抗原-抗体复合物的浓度。若用传感器的响应信号R代替[XL],Req代替反应达平衡时的响应信号,则反应速率方程为dR/dt为表面复合物的形成速率。为了更清楚地表示dR/dt与R的关系,将上式变为式中,f0≡[L]。键合反应也可用指数方程表示上式等同于Langmuir吸附等温线。如果洗脱反应物(即f0=0,在t>t0的时刻),则解吸方程为通过上树这些方程可求解反应过程的吸附速率常数ka、解吸速率常数kd,进而再根据方程(10)求得结合常数KD。求KD的方法有两种,一种是根据方程(13),绘制一系列反应物浓度不同时dR/dt相对于R的直线,直线的斜率为kobs(即kaf0+kd),再绘制kobs相对于浓度f0的直线,其斜率为ka,截距为kd,用方程(10)求KD;另一种方法是根据方程(15),绘制1n(1-Rt/Req)～t直线,斜率为kobs,再根据方程(19)绘制1n(R(t)/R(t0))～t直线,求得kd,用方程(16)求得ka,再用方程(10)求KD。2spr传感器的研究随着SPR商品仪器的问世,关于SPR传感器的研究已形成蓬勃发展的局面,成为传感器领域的研究热点。文献数量迅速增加,其中涉及应用研究的文献比理论研究的文献占了更大比重,相关综述已经发表。迄今为止,采用SPR研究过的对象包括蛋白质、多肽、DNA、复杂配合物,细菌、过敏源、病毒、毒素、药物、农药,以及葡萄糖、酒精、有机膜等物质或体系。我国关于SPR传感器的研究工作尚处于初期阶段。北京电子所及清华大学隋森芳教授在90年代初率先开始了这项研究。我们的实验室于1996年开始组装SPR装置并开展了一些研究工作。SPR传感器虽然可用于气体,液体(如水中甲醇、乙醇、糖)和固体(如有机薄膜)分析,但主要用于生物科学和生命科学领域。2.1spr传感器检测mhs通过用SPR技术进行免疫分析,可以识别抗原的种类,测定抗原的浓度,获得抗原-抗体结合的动力学常数。利用抗原-抗体亲和力和结合过程中的动态参数,不仅可以研究结构与功能的关系,而且对选择不同抗体用于治疗、检测、诊断等都具有非常实用的价值。SPR技术用于生物传感器领域诞生的第一个传感器就是免疫传感器。1983年,Liedberg等人将IgG抗体吸附在金膜上,从而发现了一种灵敏、简便的检测IgG的方法。Vandernoot等人用SPR法测定人抗IgG,已获得定量检测下限低达2×10-12mol的结果。Hutchinson等人表征了部分牛胚胎中的碳水化合物,结果表明,在1.4μg的牛胚胎中,用SPR免疫传感器可鉴别N-低聚糖和O-低聚糖。Severs等人将凝胶颗粒加入免疫反应体系,增强了测定抗原的灵敏度。此法称为增强SPR阻滞测试(EnhancedSurfacePlasmonResonanceInhibitionTest,ESPRIT)。实验包括阻滞和增强两个步骤。在阻滞步骤中,首先将一种抗原固定在SPR传感器的表面,并在反应池中放入已知浓度的同种抗原,然后加入抗体,液相中的抗原首先与抗体结合,阻滞了传感器表面抗原与抗体的结合,增加了液相中抗原的浓度,SPR信号因此减弱。在增强步骤中,则将含抗原的凝胶颗粒加入反应体系,凝胶颗粒中的抗原与吸附在传感器表面的抗体结合,从而使SPR信号增强。利用这种方法,可在低浓度下测定小分子量的抗原。免疫传感器还被成功地运用于性激素球蛋白和梅毒的鉴别。Attridge等人将荧光标记与SPR结合,制备了测定血清中人绒毛膜促性腺素(hCG)含量的SPR荧光免疫传感器。Ravanat等人研制了一步检测血浆中S蛋白抗原的SPR免疫传感器。S蛋白是一种与维生素K相关的血浆蛋白,有抗凝血作用,人体中S蛋白减少极易引起血栓的形成。他们用固定了单克隆抗体的BIAcore传感芯片,直接从血浆中捕获S蛋白抗原,对20个正常人和38个血栓患者的血浆进行测定,结果与酶联免疫分析法一致。Corr等人的工作集中在目前免疫学研究的热点—T细胞的抗原识别上。研究结果表明,2CT细胞受体只识别由MHCI类分子Ld和多肽分子p2CL形成的复合物,文献报导了这方面的最新进展。文献用动力学方法研究了免疫抗原AK和抗体之间的相互作用机理,并提出了数学模型。SPR免疫传感器在测定食品和农作物中农药残留方面也获得了可喜的成绩。1993年Minunnim发明了一种测定除草剂阿特拉津的阻滞免疫SPR传感器。将阿特拉津的一个衍生物置于传感器表面,抗阿特拉津的抗体与含有除草剂的样品混合,当抗体与阿特拉津衍生物反应时,SPR响应信号强度随着阿特拉津浓度不同而改变。最低检测限为0.05ng/mL,测定上限为1ng/mL,分析时间为15min。用SPR测定农药的较新的工作尚有测定有机磷和甲基2-苯并咪唑氨基甲酸酯;用单克隆抗体测定地表水中的西玛三嗪,检测范围为0.2～2.4μg/L。Stocklein等人研究了二苯脲的单克隆抗体-抗原复合物,得到了IgG和其Fab片段的键合动力学速率常数。随着温度降低,二者的键合能力增强,在15min内可完成0.1μg/L半抗原的测定。SPR还可用于体积较大病毒的免疫研究和疾病诊断。用一种流感病毒测定了IgG和它的Fab受体片段的键合,得到的结果低于酶联免疫法2～10倍。Fab片段比IgG的离解常数高3～10倍。SPR在病毒及艾滋病病毒(HIV)研究方面也取得了一定的结果。Karlsson等将抗单克隆抗体的Fc段耦连在传感片上,然后加入未经纯化的产生单抗的杂交瘤细胞培养上清液,单抗以捕获方式结合在传感片上,再加入HIV表面抗原P24,研究P24与四种不同单抗的反应,得出了四种单抗与艾滋病毒抗原结合的亲和力,依次为MAb18>MAb25>MAb28>MAb1,利用公式可精确计算出抗原抗体反应动力学参数。文献、报导了艾滋病病毒(HIV)研究方面的最新成果。2.2u3000利用spr技术进行蛋白质问题将SPR应用于蛋白质分子之间相互作用的研究是一项重要工作。根据SPR光谱有关理论,可计算出结合蛋白质的质量、吸附动力学曲线、解离常数和蛋白质浓度,并可推测出键合反应机理。Soulages等人用SPR技术对蛋白激酶C和类脂化合物的相互作用进行了详细研究,通过分析大量SPR光谱数据,了解到类脂层和蛋白质通过两步键合形成类脂-蛋白质大分子化合物的反应机理。Salamon等人对细胞色素C(CytC)的作用机理进行了深入研究,得到了CytC与类脂膜键合的等温曲线,并通过计算得到了周围类脂膜层的厚度、质量等结构参数信息,进而了解了CytC的作用机理:首先是CytC与类脂膜以静电作用相互结合,在表面上形成了一层致密的蛋白质膜,然后CytC中未暴露的基团与类脂膜内疏水层发生相互作用。根据其作用的程度,蛋白质部分或全部进入类脂膜,在整个过程中,键合的作用很小。在用SPR进行蛋白质的配体-受体相互作用研究方面,人们做了大量工作,一个快速鉴定、筛选未知受体和配体的比较有代表性的工作是由Bartley等人完成的。他们在用配体垂钓(ligandfishing)方法筛选和确定孤儿受体(orphan-receptor)的未知配体时,将细胞受体ECK耦联在传感片上,然后用不同细胞株的上清液通过传感片表面,以测定培养液中是否有生物分子能和ECK受体结合。如果得到阳性结果,相应的细胞上清液就可用来作为ECK亲和色谱的材料。通过这种一步纯化的方法能得到足够纯的ECK配体,用于N端蛋白质序列分析,确定此配体为B61。在蛋白质折迭机理研究方面,Hartl等人用SPR技术取得了极有价值的研究成果。细胞中新合成的蛋白需要折迭蛋白参与折迭才能发挥功能。已知在细菌中有两组折迭蛋白GroEL和GroES,能在ATP参与下,形成循环反应。Hartl等人将GroEL耦联于传感片上,然后使GroES和ATP或ATP的类似物(但不能水解),一起流经传感片表面。从传感片获得的曲线图上可以看到,GroEL能和GroES结合,而ATP的存在能使GroES迅速从GroEL上解离下来(ATP的类似物却不能)。据此,他们提出了折迭蛋白工作机理模型,即:GroES结合在双环形GroEL(新合成的多肽结合在双环中)一端,当ATP与GroEL结合并被水解时,GroES也被解离下来。如此循环,就可以帮助新生蛋白正确折迭。计算ATP存在时GroES的解离常数,表明其kd值和ATP被水解时的kd值相当,证明了模型的可信性。用SPR传感技术进行蛋白质分子之间相互作用的研究有大量文献报道[40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70],在确定蛋白质分子之间作用机理,监测其结构变化等方面都取得了有价值的研究结果。2.3ets1抑制剂与乳状液的耦合作用DNA与蛋白质之间的相互作用,特别是反应动力学测定,一直没有简便快捷的方法。以前需要用同位素标记,并且无法测定动力学常数。采用SPR技术,将含乳糖操纵子的DNA片段耦联在传感片表面,使不同浓度的抑制蛋白流经传感片表面,从SPR光谱可以精确地计算出反应动力学常数和结合亲和力。ETS1癌基因蛋白能和某些基因的DNA调控区结合,调节这些基因的表达。以前的研究已确定能和ETS1结合的DNA序列。Fisher博士等揭示了ETS1蛋白和耦联在传感片上含ETS1结合DNA的结合,并用合成的含37个氨基酸的多肽K37N(从蛋白质序列363～400)证明了ETS1蛋白的结合区域。2.4其它技术的应用SPR技术不仅可用于研究蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA之间的相互作用,也可用于研究核酸间的相互作用,实时追踪核酸反应的全过程,包括基因装配、DNA合成延伸、内切酶对双链DNA的特异切割。这些都是其它技术无法比拟的。Nilsson等将一个69bp的双链DNA装配在传感片上,当69bp的DNA装配并形成单链后,进一步进行引物主导的合成。Jordan等人用SPR表征了金膜表面DNA的杂交吸附及DNA表面上链亲和素的固定,用SPR监测了在金膜表面单链DNA和生物素标记的寡核苷酸互补序列的杂交反应,表面固定DNA的绝对覆盖量为3×1012分子/cm2。最近,Okahata等人成功地研究了固定在SPR传感器表面的10～30个碱基的寡核苷酸与互补DNA杂交反应的动力学,得到的结果与石英晶微天平的结果一致。Corn等人也详细报道了用SPR技术研究DNA杂交反应及测定DNA序列的结果。2.5筛选细胞因子抗物药物筛选是SPR技术的另一个应用热点。1995年Kalab首次将其应用于茶叶碱的研究。最近,Adamczyk研究了甲状线素衍生物(一种治疗精神病的药物)和抗-T-4Fab片段的同位素指示剂的键合情况,随后文献又报道了4种药物(FA-2,HPD,Hoechst33258和Tilorone)和互补DNA之间的相互作用。他们将生物素标记的DNA固定在链霉亲和素-右旋糖苷-金组成的三层膜上,通过流动注射将药物注入样品池,形成DNA-药物复合物,50mmol/L的NaOH可解离此复合物。美国的Schering-Plough制药公司利用SPR技术发展出简便、快速、准确地筛选细胞因子拮抗物的方法。筛选时首先将细胞因子受体耦联于传感片上,然后将细胞因子和筛选物在加样前混合,混合后的样品流经传感片表面。如果筛选物对指定的细胞因子有拮抗作用,样品中的细胞因子与传感片上受体之间的相互作用会减弱或消失,反之细胞因子与受体不受影响。文献研究了静脉内药物的传输和分布,文献研究了细菌对万古霉素等产生抗药性的机理,均取得了很好结果。3高灵敏度的分析方法虽然SPR作为生物传感器有许多优点,但其灵敏度有限。SPR的测量范围主要与物质的分子量有关,对于分子量大于1000的物质,典型的浓度测定范围为nmol/L～μmol/L,而对于分子量小于1000的物质,典型的浓度测定范围为μmol/L～mmol/L。积极探索各种高灵敏度的分析方法已成为SPR研究中的一个主要内容。在提高灵敏度方面,人们已做了大量工作。3.1金纳米粒子的实验研究SPR研究的一个最新进展是将纳米技术应用于配体-受体结合过程,从而极大地提高了SPR方法的灵敏度。Severns等人首先提出用亚微米胶粒的放大步骤增强灵敏度的方法,将含有抗原的亚微米胶粒与固定在传感片表面的抗体结合,测定hCG的灵敏度提高了30倍。1994年Leung等人从理论上提出了粒子增强提高SPR灵敏度的不规则团(fractal-cluster)模式。他们用高折射率的金胶粒与低折射率的聚苯乙烯和二氧化钛相比较,结果表明,膜表面含金胶粒团能增强SPR的响应信号,增强的程度则取决于粒子体积的大小。随着纳米技术的飞速发展,最近He等人也提出了利用纳米技术提高SPR灵敏度的方法,其原理与Severns和Leung等人所提出的有相似之处。他们在DNA杂交实验的SPR研究中,首先将单链DNA固定在金膜表面,然后将胶体金纳米粒子粘接在单链DNA上,并将其引入样品池与互补DNA相接触,发生杂交反应,通过金膜和金纳米粒子的电场耦合放大作用,极大地提高了测定DNA的灵敏度。Steiner等采用离子注入技术,利用银离子团在棱镜与银膜界面处的电场放大作用,提高SPR方法的灵敏度。同时由于离子注入技术采用的是高能金属离子,在光学支持体表面可形成非常稳定牢固的离子注入银团(ionimplantedsilverclusters),极大地提高了传感芯片的使用寿命。3.2增敏夹层spr传感器生物素是生物体内广泛分布的一种羧化酶的辅酶。亲和素是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白,每个亚基含一个可与生物素结合的位点,两者的亲和常数高达1015mol-1s-1。因此,亲和素与生物素之间具有高度专一的相互作用。1997年Corn等人用生物素标记的寡核苷酸与固定在金膜表面的DNA反应,再让链霉亲和素与生物素标记的寡核苷酸反应,将SPR测定的检测限降低了四分之三。通过DNA杂交结合及生物素-亲和素连接,可形成6层链状生物素膜,进一步放大了DNA杂交反应产生的SPR信号。最近利用生物素-亲和素系统放大作用进行的SPR实验,将测量灵敏度提高了4×104倍,检测下限达pmol级。该实验设计了一个脂质体(liposome)增敏夹层SPR免疫传感器。首先将聚苯乙烯层吸附在金膜表面,然后,单克隆抗体通过物理吸附连接到聚苯乙烯层上,再向样品池中引入含干扰素和亲和素的样品溶液,最后,再注入生物素化的抗体。亲和素象一座桥梁将生物素化的抗体与脂质体抗体连接起来,极大地提高了检测灵敏度。3.3介质性能检测SPR研究中的一个新进展,是将电化学调制用于监测SPR传感片表面膜内的静电场,称为椭圆显微术-SPR(EM-SPR)。由于折射率的变化与光电效应线性相关,所以,可用EM-SPR测定介质折射率变化。Hanken等人利用EM-SPR测定HAPA(偶氮苯生色团)单层膜的折射率变化,最低为8×10-6折射率单位。此外,EM-SPR还是一种光学法研究薄膜内静电场的良好方法,通过测定折射率值,求得电场强度,并通过改变HAPA分子在有机膜内的位置,研究电场的情况。Iwasaki等人则将循环伏安法与SPR结合,分析金电极表面的吸附、解吸和扩散过程。法拉弟电流与电极表面的浓度梯度成比例,而SPR仅能给出电极表面的浓度。3.4spr-pds检测为了提高SPR的灵敏度,在检测器系统的研究和改进方面做了许多工作。光声光谱(PAS)和光热偏转光谱(PDS)与SPR中常用的发光二级管阵列检测器相配合,可提高SPR的检测灵敏度。PAS信号是基于样品吸收的能量,而通常SPR所检测的是未被吸收的能量。Inagaki等人通过在密封样品池中耦合一个麦克风,建立了银膜表面SPR激发非辐射衰减光声光谱法。表面等离子体子共振时释放的热能,在银膜-样品-空气界面引起周期性的压力变化,利用样品池中的麦克风可检测到这种变化。PAS是一种性能优良的检测器,但是它要求样品池必须能防止其它声音的干扰。光热偏转光谱(PDS)受周围环境的影响很小,尤其适合空气中的免疫分析,灵敏度高于PAS。Lai等人的工作表明,PDS非常适合作SPR的检测器。他们在实验中将IgG单层膜抗体固定在银膜上,用去离子水冲洗后,置于空气中干燥,然后用SPR-PDS进行检测。用He-Ne激光探针光束照射银膜表面,当共振发生时,非辐射热能传输至膜表面附近的空气,在空气介质中,银膜的折射率产生梯度变化,当探针光束通过折射率呈梯度变化的薄膜时,在垂直于表面的方向上将产生偏转,用一个双面透镜将探针光束的反射光分离出来,使其通过一个很小的针孔,进入光电二极管检测器,通过锁相放大提高灵敏度。然后,将IgG的抗原样品溶液与IgG抗体膜接触,只需要很少的样品即可发生预定的免疫反应。将样品表面淋洗和干燥之后,用SPR-PDS测定IgG抗原浓度,检测限可达2×10-7g或者1×10-12mol。如果用功率更高的激光,检测限会更低,不过,抗原-抗体键合反应所需温育时间可能会更长。3.5spr和pahs的相互作用SPR方法一个主要的局限性就是无法区分非特异性吸附。最新的SPR研究工作正在克服这一缺点。用具有高检测灵敏度和较宽检测质量范围的飞行时间质谱法(TOFMS)可检测在金属膜表面形成的抗原-抗体复合物的变化。Krone等首次用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱法(MALDI-TOFMS)做为SPR的检测装置,测定生物分子之间的相互作用,通过抗原-抗体的免疫反应,定量测定了fmol级的肽和肌毒α(myotoxinα)。Nelson改进了这一工作,在用SPR技术监测生物分子之间的相互作用的同时,直接用MALDI-TOFMS检测流通池中SPR所监测的组分。该方法的检测限低于fmol级。Nelson还用SPR监测光纤探针表面多