细胞工程制药技术 细胞融合

生化制药工艺项目四

细胞工程制药技术1细胞融合2植物细胞培养技术3动物细胞培养技术目录CONTENTS01细胞融合Part1细胞融合一、细胞融合概念1、细胞融合概念（cellfusion）又称体细胞杂交（somatichybridization），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程2、细胞融合的历史Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞20世纪80年代出现了电融合技术Part1细胞融合一、细胞融合概念3、细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，对于种质资源的开发和利用具有深远的意义融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备Part1细胞融合二、细胞融合原理与过程1、细胞融合的原理在自发或人工诱导下，两个细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体（heterokaryon）、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞（观看视频：细胞融合）融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程显微镜下细胞融合过程Part1细胞融合二、细胞融合原理与过程2、动植物细胞融合示例植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图Part1细胞融合三、细胞融合方法1、生物法--仙台病毒法四个阶段两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适pH为8.0-8.2细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP融合成巨大细胞，仍需ATPPart1细胞融合三、细胞融合方法2、化学法--聚乙二醇（PEG）法作用机理由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能特点融合成本低，勿需特殊设备融合子产生的异核率较高融合过程不受物种限制缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害Part1细胞融合三、细胞融合方法3、物理法--电融合法作用机理电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜，形成融合体特点融合率高、重复性强、对细胞伤害小装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程可直接挑选杂种细胞免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强注意事项：对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质注意控制高频交流电压和脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。Part1细胞融合三、细胞融合方法3、物理法--电融合法过程细胞膜的接触当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串膜的击穿原生质体成串排列后，立即给予高频脉冲电流就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起（A）在高频电流电场下的相互接触。（B）脉冲刺激30s后（C）50s后（D）1.5分钟后（E）6分钟后（F）15分钟后，原生质体融合完成。（观看视频：电融合）Part1细胞融合四、融合细胞的筛选方法1、融合细胞类型根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型异核细胞：非同源细胞的融合体同核细胞：两个相同细胞的融合体多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体2、植物细胞筛选方式遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长Part1细胞融合四、融合细胞的筛选方法2、植物细胞筛选方式抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体亲本2：叶肉细胞原生质体在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分Part1细胞融合四、融合细胞的筛选方法2、植物细胞筛选方式利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素（观看视频：植物细胞融合及应用）Part1细胞融合四、融合细胞的筛选方法3、动物细胞筛选方式利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡（观看视频：利用HAT培养基筛选融合细胞）Part1细胞融合四、融合细胞的筛选方法3、动物细胞筛选方式温度敏感突变