野生软枣猕猴桃总黄酮的抑菌作用研究

野生软枣猕猴桃总黄酮的抑菌作用研究

野生软枣和桃园通常被称为软枣。它自然生长在中国东北的林区。用于治疗各种疾病。其果实翠绿,清香爽口,柔软多汁,营养丰富,食药兼用,经济、医疗价值很高。类黄酮是植物产生的一类天然有机化合物,有消炎、抗病毒、抗衰老等作用,尤其具有很强的抗菌作用,越来越多的黄酮类化合物从植物中被分离出来。野生软枣猕猴桃果实中含有黄酮,目前国内对野生软枣猕猴桃果实的抑菌活性研究的报道近乎空白,有很广阔的开发潜力。本试验旨在研究野生软枣猕猴桃总黄酮的抑菌活性,为进一步开发和利用野生软枣猕猴桃资源提供理论和试验依据。1材料和方法1.1供试菌株、仪器和试验设备野生软枣猕猴桃:辽宁省本溪市;野生软枣猕猴桃总黄酮:试验室自制。细菌:大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);真菌:根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、热带假丝酵母(G.tropicalis)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)由沈阳农业大学食品学院微生物试验室提供。供试培养基:细菌2种菌株采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(BPA)。真菌5种菌株采用马铃薯培养基(PDA)。详见下1.2.2.1培养基的制备。滤纸圆片为直径6mm,厚度1.5mm的定性滤纸。RE-52旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;5805高速冷冻离心机:INVESTMENT;DZF-6050真空干燥箱:上海沪粤明科学仪器有限公司;TU-1810紫外-可见分光光度计:深圳市凯铭杰仪器有限公司;HZP-150型全温振荡培养箱:上海精宏试验设备有限公司;BOXUN超净台:上海优浦科学仪器有限公司;HVE-50高压灭菌锅:HIRAYAMA;PB-10pH计:sartorius公司。1.2测试方法1.2.1研细制备研磨取冷藏的野生软枣猕猴桃,融化后用蒸馏水洗净,晾干,置恒温箱内60℃烘干,研细备用。将备好的野生软枣猕猴桃干粉于60%的乙醇、80℃、料液比1∶10的条件下浸提8h,抽滤,滤液于旋转蒸发器中60℃下减压浓缩至无醇味,回收乙醇,浓缩液即为野生软枣猕猴桃总黄酮,备用。1.2.2野生软枣和桃黄酮的黄酮污染试验1.2.2.水2.4%细菌培养基(BPA):牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15g~20g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4;霉菌及酵母菌培养基(PDA):马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15~20g,水1000mL。1.2.2.菌种的培养时间将7种上述供试菌种分别接入相应的斜面培养基上进行活化,细菌置于37℃的恒温培养箱中培养24h,真菌置于28℃的恒温培养箱中培养48h。然后分别挑取1环已活化好的菌种放入9mL无菌水中,震荡摇匀,制成一系列菌悬液,浓度约为106~108CFU/mL,备用。1.2.2.最大浓度5个浓度取野生软枣猕猴桃总黄酮,溶解稀释,得到5个浓度:100mg/mL,50mg/mL,25mg/mL,10mg/mL,5mg/mL。1.2.2.最小抑制浓度测定采用琼脂扩散滤纸片法测定抑菌圈直径,采用菌落直接观察法测定最小抑制浓度。方法见参考文献,稍有改动。本试验用的滤纸片直径为6mm,每个平皿贴7片。见表1和表2。1.2.2.ph对总黄酮抑菌活性的影响(1)温度对野生软枣猕猴桃总黄酮抑菌效果的影响:分别移取10mL质量浓度为100mg/mL的野生软枣猕猴桃总黄酮供试液于3个小烧杯中,分别放入直径为6mm的滤纸片(121℃条件下20min干热灭菌),在25℃,50℃,75℃水浴中加热浸泡1h。以大肠杆菌为代表菌,以生理盐水为空白对照液,用琼脂扩散滤纸片法测定不同温度下的抑菌圈直径,重复该操作3次,见表3。(2)pH对野生软枣猕猴桃总黄酮抑菌活性的影响:取6个小烧杯,分别移取10mL质量浓度为100mg/mL的野生软枣猕猴桃总黄酮供试液,用0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH配制成pH为4,5,6,7,8,9的不同溶液。分别放入上述处理过的滤纸片,浸泡30min。以大肠杆菌及啤酒酵母为代表菌,以生理盐水为空白对照液,比较不同pH对野生软枣猕猴桃总黄酮抑菌活性的影响,重复操作3次,结果见表4。2最小抑制浓度mic由表1、2可知,野生软枣猕猴桃总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、根霉、米曲霉、热带假丝酵母、啤酒酵母均有抑制效果,且作用相当;随着总黄酮质量浓度的增大,抑制作用增强;最小抑制浓度(MIC)在25~50mg/mL之间。野生软枣猕猴桃总黄酮对上述菌种的抑菌效果依次是:细菌>酵母菌>霉菌,而对黑曲霉没有抑制作用,这说明野生软枣猕猴桃总黄酮对霉菌的抑制有选择性。由表3可知,以生理盐水为空白对照液,温度越高,抑菌圈直径越大,即野生软枣猕猴桃总黄酮的抑菌效果越明显,因为温度升高,野生软枣猕猴桃总黄酮溶液有浓缩的趋势。由表4可知,以生理盐水为空白对照液,pH对野生软枣猕猴桃总黄酮的抑菌效果有明显的影响,偏酸性的pH更有利于抑菌,在pH5~6范围内,抑菌效果较好。3野生软枣猕猴桃总黄酮的抑菌效果(1)野生软枣猕猴桃总黄酮具有一定的抑菌作用。对常见细菌和酵母菌都有较好的抑菌效果,对霉菌的抑制作用具有选择性,对供试的黑曲霉没有抑制效果,抑菌效果依次是:细菌>酵母菌>霉菌。对同一个菌种而言,抑制效果随总黄酮浓度的增大而显著提高。野生软枣猕猴桃总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、根霉、米曲霉、热带假丝酵母、啤酒酵母最小抑制浓度在25~50mg/mL。(2)温度和pH对野生软枣猕猴桃总黄酮的抑菌效果也有一定影响。通过生理盐水的对照,试验表明,