结核病小鼠肺部病理变化与细胞亚群的关系

结核病小鼠肺部病理变化与细胞亚群的关系

在过去10年中，全球卫生发病率显著增加。经世界卫生组织调查,全球约有1/3的人口感染了结核分枝杆菌。尽管卡介苗的普遍应用和药物治疗有效性的不断提高,结核病仍然是全世界范围内最普遍的传染性疾病之一。我国是结核病高负担国家之一,结核病人数仅次于印度而居世界第二位。人类虽然对结核分枝杆菌的感染率很高,但发病率却较低,携菌人群比例较高。母牛分枝杆菌菌苗(微卡菌苗)系母牛分枝杆菌加热灭活制剂,对人不致病,能增强免疫力,艾滋病等免疫缺陷者和各类人群均可使用,不引起菌血症和变态反应,能用于成人结核病的免疫预防,但该菌苗在活动性结核病中所起作用尚且不知,尤其对CD4+、γδT细胞亚群作用不清楚。本文拟用人型结核杆菌标准毒力株(H37RV)建立小鼠结核病模型,观察小鼠肺组织病理变化,并用流式细胞术检测微卡菌苗治疗结核病模型小鼠前后外周血T细胞亚群变化,以探讨结核病感染中肺组织损伤程度与T细胞亚群变化的相关性,以及为微卡菌苗用于临床治疗结核病提供实验依据。1材料和方法1.1微生物和抗鼠动物:健康雄性C57BL小鼠,4～6周龄,体重18～22g,SPF级。购自中国医学科学院实验动物研究所,饲养于安徽龙科马生物制药有限公司动物实验中心SPF级动物室。H37RV标准毒力株:由安徽省龙科马生物制药有限公司动物实验中心提供,毒力指数为60。按常规接种于罗氏鸡蛋培养基上,37℃斜面培养3～4周。微卡菌苗:由安徽省龙科马生物制药有限公司动物实验中心惠赠。抗体:抗鼠CD3、CD4、CD8和γδT细胞单克隆抗体,购自深圳达科为生物技术有限公司。流式细胞仪:FACSCalibnr,BD公司。1.2方法1.2.1小鼠分枝杆菌的制备实验动物随机分为3组:结核病模型组,免疫调节剂组,正常对照组,每组20只。结核病小鼠模型的建立:取在改良罗氏培养基上生长良好的结核分枝杆菌(H37RV)的培养物,经磨菌管充分研磨成匀浆后用生理盐水稀释,配制成7mg/ml(1×106CFU)的菌体混悬液,每只小鼠经球后静脉丛注射0.05ml。免疫调节剂组:按结核感染组同样剂量和方法复制小鼠结核病模型,然后在感染后第3、10、17天,分别于每只小鼠的股部肌肉注射微卡菌苗22.5μg(溶于1ml生理盐水中,每侧肌注0.5ml)。1.2.2小鼠需要免疫调节剂治疗结核病模型组小鼠于感染后4周,每只小鼠采用摘除眼球法取外周血0.3～0.5ml,保存于肝素抗凝的Eppendorf管中室温保存,免疫调节剂组和正常对照组小鼠同期同方法处理。用流式细胞仪分别测定外周血CD3+、CD4+、CD8+、γδT细胞的相对数量,结果以百分比表示。1.2.3中性甲醛中苏叶红染色取血后小鼠脱颈处死,取出肺脏立即放入10%中性甲醛中固定,经脱水、透明、浸蜡、包埋和切片,厚4μm,分别做苏木精-伊红染色(HE)及抗酸染色。1.3统计处理不同组小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+、γδT细胞相对数值(百分比)均以表示,采用方差分析进行比较。2结果2.1小肺组织病理学改变2.1.1大量炎性细胞浸渍感染4周后,结核病模型组大部分肺组织实变,多数肺泡腔消失,肺泡隔重度增宽,肺间质内可见大量炎性细胞浸润,浸润细胞以中性粒细胞为主,淋巴细胞较少。残存的肺泡腔中有红细胞、纤维素渗出(见图1A)。免疫调节剂组肺组织病变和结核病模型组大致相似,但实变病灶较少,多数肺泡腔存在,肺泡隔内浸润淋巴细胞较多,肺泡腔内有渗出单核-巨噬细胞(见图1B)。2.1.2分枝杆菌细胞感染4周后,结核病模型组肺实变区内分布大量的紫红色结核分枝杆菌,主要存在于单核-巨噬细胞胞质内,肺泡实变区内变性坏死的中性粒细胞较多(见图1C)。免疫调节剂组肺实变区内结核分枝杆菌明显少于结核病模型组(见图1D)。2.2降低0.0pp感染4周后,结核病模型组CD3+、CD4+、CD8+和γδT细胞比例均较正常对照组降低(P<0.05～P<0.01)。与结核病模型组比较,免疫调节剂组均能增加CD3+、CD4+和γδT细胞比例(P<0.05～P<0.01),而CD8+T细胞比例和CD4+/CD8+比值均未伴随用药出现明显变化(P>0.05)(见表1)。3免疫调节剂的作用结核病是结核杆菌引起的传染性疾病,在其病程中,引起T细胞介导的免疫应答,细胞介导免疫是机体抗结核分枝杆菌的主要防御机制。结核病的免疫主要是T细胞介导的细胞免疫,对结核病的发病和演变具有决定性意义,尤其是CD4+、CD8+、γδT细胞的数量和功能与结核病的病情进展和转归密切相关。李柏青等研究资料表明肺结核患者处于免疫低下状态,CD4+T细胞和γδT细胞均参与机体抗结核分枝杆菌感染的保护性机制。CD4+T细胞在激活、趋化巨噬细胞,促进巨噬细胞完全杀灭结核分枝杆菌等方面起着重要的作用。肺结核患者外周血的CD4+T细胞的水平明显低于健康人,CD4+T细胞有随疾病严重而降低的趋势,表明CD4+T细胞在结核病免疫防御机制中占有重要地位,CD4+T细胞的降低可能是结核病恶化的原因之一。CD8+T细胞在结核病中的免疫作用观点不一,有研究者认为,结核病治疗失败或复发的关键是由于被结核分枝杆菌感染的靶细胞的存在,CD8+T细胞数过少或是CD4+和CD8+双受体开放的T细胞数量不足,就无法清除靶细胞及其所保护的结核分枝杆菌。CD8+T细胞在调节免疫,发挥细胞毒作用,溶解受感染后失去了免疫活性的靶细胞或使之凋亡,促使结核菌暴露及病灶清除等方面有重要的作用。γδT细胞是针对结核杆菌感染的细胞免疫应答中另一主要的T细胞亚群,分枝杆菌抗原可激活γδT细胞在入侵的局部聚集、增殖,从而消灭这些病原菌。γδT细胞的活化和增殖,参与抗结核分枝杆菌的免疫应答。结核病治疗以化疗为主,但是常规化疗并不能直接纠正已经启动的异常免疫应答,而且近年来,由于耐药菌株的增多,单纯化疗难以达到理想的治疗目的。国内外研究者在结核化疗的同时,已开展结核病免疫治疗方面的研究。潘家华等研究卡介苗配用腺苷接种可提高巨噬细胞抗结核杆菌的效能。微卡菌苗是含有与结核分枝杆菌相似的共同抗原,是双相免疫调节剂,能使对机体起损害作用的超敏反应减弱,也能使低落的保护性免疫反应增强。庄玉辉等在动物实验中发现微卡菌苗对于T淋巴细胞反应有明显促进作用,使机体杀灭结核分枝杆菌作用明显增强。周峰等联用微卡菌苗治疗淋巴结结核,一方面能增强机体免疫力,另一方面能降低机体敏感性,抑制上述过强的变态反应,减轻病理损害。治疗组在病理治愈方面优于对照组。严重感染患者治疗过程中出现暂时性恶化情况,治疗组少于对照组(P<0.01),说明微卡菌苗起到了抑制降低机体的变态反应(过敏反应)的作用。我们的研究结果表明,结核病模型组小鼠的肺部病变主要以肺泡间质、支气管周围炎及肺泡腔内大量中性粒细胞浸润为特征,缺乏浸润淋巴细胞,外周血T细胞亚群检测结果显示CD3+、CD4+、CD8+和γδT细胞的相对比例均降低(P<0.05～P<0.01)。表明T细胞免疫功能受到抑制。故抗结核菌能力弱,肺实变区内见密集结核分枝杆菌分布,大量浸润中性粒细胞释放炎症介质导致肺组织严重损伤。免疫调节剂组与结核病模型组比较,外周血CD3+、CD4+和γδT细胞比例均呈现升高,γδT细胞在抗感染中起着保护组织不受损伤的作用,故肺部病变范围和程度明显减轻,分枝杆菌感染细胞明显减少。从实验我们可以看出结核病动物模型中肺病理改变和细胞免疫具有相关性。实验结果亦表明,微卡菌苗可以促进T淋巴细胞增殖,增强细胞免疫功能。并且能减轻肺部病变,促进肺部病变的吸收,有利于机体的恢复。但是免疫调节剂组CD8+T细胞和CD4+/C