苦参中主要生物碱成分的测定

苦参中主要生物碱成分的测定

苦参是大豆科植物苦参的干燥根，最初被记录在《神农本草经》中。苦、寒、心、肝、胃、结肠、膀胱。具有清热除湿、杀虫利尿的功效。主要治疗热脉、大便、黄疸、尿关、红白带、瘙痒、阴瘙痒、湿疹、皮肤瘙痒、真菌病和其他外科性疾病。苦参的主要活性成分为生物碱类、黄酮类合物。研究表明,苦参中的生物碱类具有抗炎、抗心律失常、抗肿瘤、免疫调节等多方面的药理作用。目前苦参的质量评价多以苦参碱和氧化苦参碱作为指标,此外苦参中槐果碱、氧化槐果碱以及槐定碱也具有较高的含量。中药的多成分、多功效的作用特点,决定着单一成分难以表达中药的质量,因此,多成分多指标含量测定是当前国际上广泛认可的质量评价模式。将5种生物碱同时测定运用于苦参药材的质量评价,能使结果更具准确性和科学性。为了方便日常苦参药材质量评价研究工作,本研究尝试使用“一测多评”法,以氧化苦参碱为参照物,计算氧化苦参碱与苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱以及槐定碱的相对校正因子,建立苦参药材的一测多评多指标质量控制方法。1药品、试剂与仪器20A,SartoriusBP211D1/10万电子天平,KQ-500E超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈(欧普森色谱纯);无水乙醇(天津科密欧色谱纯);其他试剂为分析纯;水为超纯水;苦参碱对照品(批号110805-200508),氧化苦参碱对照品(批号110780-201007),槐定碱对照品(批号110784-200804),氧化槐果碱对照品(批号111652-200301)均购自中国食品药品检定研究院;槐果碱对照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批号11052422)。苦参药材和饮片采购自山西、内蒙古、贵州、广西等地,经广东药学院生药教研室李书渊教授鉴定为苦参S.flavescens药材。2方法和结果2.11个研究和多评价理论的研究2.1.1流动相0.1010Inertsil-NH2色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10);流速1.0mL·min-1;柱温30℃;检测波长210nm;进样量20μL。在上述色谱条件下,各组分分离度良好,色谱图见图1。2.1.2对照品溶液的制备分别取槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱(以92.3%计算)对照品适量,精密称定,加乙腈-无水乙醇(80∶20)溶解,分别制成每1mL含槐果碱0.6520mg、苦参碱0.5520mg、氧化槐果碱0.5680mg、槐定碱0.4160mg、氧化苦参碱0.4763mg的溶液,作为对照品溶液。取槐果碱对照品溶液0.1mL、苦参碱对照品溶液0.2mL、氧化槐果碱对照品溶液1.5mL、槐定碱对照品溶液0.3mL和氧化苦参碱对照品溶液5mL至10mL量瓶中,加乙腈-无水乙醇(80∶20)定容,得混合对照品溶液。2.1.3氯甲烷-三氯甲烷-甲醇法取采购自不同产地的苦参药材或饮片粉末各0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加浓氨溶液0.5mL,三氯甲烷20mL,超声处理30min,放冷,再称重,用三氯甲烷补足失重,摇匀,滤过,精密量取续滤液5mL,过中性氧化铝柱(100~200目,5g,内径1cm),依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液各20mL洗脱,合并洗脱液,回收溶剂至干,残渣加无水乙醇适量使溶解,转移至10mL量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀,即得。2.1.4g线性关系测定结果精密吸取混合对照品溶液2,5,10,15,20,25,30μL注入液相色谱仪,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。回归方程分别为槐果碱y=2.051×106x-4.695×103,R2=0.9997;苦参碱y=1.347×106x-6.872×103,R2=0.9996;氧化槐果碱y=2.195×106x-2.550×104,R2=1.000;槐定碱y=1.304×106x-1.373×104,R2=0.9997;氧化苦参碱y=1.231×106x-3.459×104,R2=0.9996。表明槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱分别在0.01304~0.1956,0.1704~2.556,0.02208~0.3312,0.02496~0.3744,0.4760~7.140μg线性关系良好。2.1.5精密度试验精密吸取混合对照品溶液20μL,连续进样5次,记录色谱峰的峰面积,结果槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为0.48%,0.95%,0.14%,2.9%,0.13%,结果表明,仪器精密度较好。2.1.6峰面积rsd测定取山西沁县-1苦参药材供试品溶液1份,分别于0,2,4,8,12,24,48h进样测定,结果槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为2.1%,2.4%,0.98%,2.7%,2.5%。结果表明,供试品溶液稳定性良好。2.1.7碱土质量测定结果取山西沁县-1苦参药材粉末共6份,按供试品制备方法制备,分别测定其含量,结果槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱含量测定的RSD分别为1.2%,1.7%,0.98%,2.1%,1.0%。结果表明,本方法重复性较好。2.1.8对照品溶液的制备精密吸取上述槐果碱对照品溶液0.05mL、苦参碱对照品溶液0.15mL、氧化槐果碱对照品溶液1.5mL、槐定碱对照品溶液0.6mL、氧化苦参碱对照品溶液7mL置具塞锥形瓶中,挥干溶剂,共6份。分别取已知含量的苦参药材粉末约0.15g,精密称定,置上述加对照品的锥形瓶中,按2.1.3制备供试品溶液,同法制备6份加样回收溶液。精密吸取加样回收溶液20μL,注入液相色谱仪,测定。计算回收率,结果见表1。2.2修正因子的测量以氧化苦参碱(e)为内标,计算槐果碱(a)、苦参碱(b)、氧化槐果碱(c)、槐定碱(d)的校正因子,见表2。2.3重建因子的再现研究2.3.1高效液相色谱测定实验在Waters2996-2695,Agilent1200,岛津LC-20A3种高效液相色谱系统进行,使用Inertsil-NH2色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),精密吸取混合对照品溶液2,5,10,15,20,25,30μL注入液相色谱仪测定,结果见表3。结果证明,不同色谱仪所得的相对校正因子无明显差异。2.3.2柱法的检查2.3.3高效液相色谱法实验采用建立的一测多评实验方法在经2个实验室不同实验人员进行复核实验,在Waters2996-2695高效液相色谱仪上,使用InertsilNH2(4.6mm×250mm,5μm)进行实验,精密吸取混合对照品溶液2,5,10,15,20,25,30μL注入液相色谱仪测定,结果见表5。实验证明,所建立的一测多评方法在经2个实验室不同实验人员进行复核所得的相对校正因子相对误差均小于3%,无明显差异。2.4相对保留时间的确定通过计算在不同色谱仪器或不同色谱柱中各待测成分色谱峰与氧化苦参碱色谱峰的相对保留时间,对各待测成分进行定位,结果见表6。结果证明,不同仪器和色谱柱测得的相对保留时间相对误差均小于5%,利用相对保留时间进行峰的定位是可行的。实验所得的氧化苦参碱与槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱的保留时间差为2.042,1.499,1.264,1.086可供参考。在一测多评法的实际应用中可参考药材典型色谱图,利用相对保留值定位,并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征,能正确判断待测成分峰的位置。2.5苦参药材含量测定取采购自不同产地的苦参药材和饮片粉末,按供试品溶液制备方法制备,精密吸取20μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,采用外标法与一测多评法计算各产地苦参药材中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱和氧化苦参碱的含量,结果见表7。比较常规的外标法实测含量与一测多评计算的含量的相对误差,结果均在小于3%,表明2种含量测定方法得到的含量之间无显著性差异,说明QAMS在苦参的多指标成分质量评价中应用是可行的。3苦参中各化合物含量测定本实验使用考察了不同的色谱柱、不同的色谱仪以及不同的实验室不同实验员条件下相对校正因子的重现性,实验结果证明,各相对校正因子重现性好。经过对比外标法和一测多评法的结果,运用统计学软件处理,发现2种方法计算出的结果无显著性差异。说明本实验计算得到的相对校正因子可以作为一个稳定的参数运用于5种生物碱类成分含量的计算中,在对照品缺省的情况下可实现其定量。本文首次将一测多评法运用于苦参的质量评价中,在实际应用时,可以仅使用氧化苦参碱对照品,根据参照峰的保留时间,利用相对保留值作为定位标准对色谱峰进行定位,参考所得的相对校正因子,计算出苦参中其他4种生物碱的含量。一测多评法是本着“发挥科研为标准服务,标准为生产实际服务”的指导思想,在严格的方法学和交叉验证的基础上,只测定某个代表性成分(易得、廉价、有效),同时计算出其他待测有效成分的含量,使其计算值与实测值符合定量方法学的要求。2010年版《中国药典》一部已经收录了该方法,运用于黄连药材饮片含量测定中。而一些对照品难得、指标少的药材也开始尝试建立一测多评的方法运用于含量测定中,如三七、黄芪、秦皮等。槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱是苦参药材中的主要成分,现代药理研究表明,这些成分的药理活性与苦参的功效具有相关性。苦参作为一种常用药,广泛的运用于生活,如杀虫剂、清洁洗剂、注射剂、成药等对苦参药材质量进行控制是保证用药安全的重要手段。关于苦参药材质量评价方面研究越来越多的使用到这5种成分作为指标性成分,对苦参药材进行有效成分定量以及质量评价的依据。本实验选择这5种生物碱作为苦参的质量控制指标,并建立它们之间的相对校正因子,不仅能解决对照品缺乏的现象,还能节省成本,并且能方便的运用到日常的药材质量检测中,这与“一测多