基于系统生物学的药物研究的方向和进展

基于系统生物学的药物研究的方向和进展

发现药物是人类疾病斗争不可持续的手段之一。但是药物发现又是非常昂贵且耗时的。据统计,发达国家研制成功一种新药平均需要9~12年,耗资约8~12亿美元。自从PaulEhrlich在20世纪初提出“化合物受体存在”的学说后,期望设计能与疾病发生发展过程中的关键靶标高度特异地结合的“魔术子弹”(magicbullet),成为现代药物发现的核心问题。自20世纪70年代以来,这种“一药,一靶,一病”的还原论方法加速了药物发现的步伐,支持着制药工业持续、稳定的高速增长。然而,这种繁荣的情形在最近十年来已不复存在,制药行业正面临日益巨大的压力:药物发现过程的损耗率显著增加,统计数据显示,导致目前药物发现高损耗率的两大主要因素是疗效差,毒副作用高,这两方面各占损耗率的30%。新化学实体(newchemicalentities,NCE)的数量逐年呈下降的趋势,从年平均30个左右下降到2005和2006年每年只有18个。而且,由于21世纪前10年是世界专利药集中到期阶段,自2010年起,世界制药行业将遭遇近40年来首次在利润上的大幅下滑。这种困境下,人们开始对过去几十年药物研究中单一靶点药物的主导理念进行了反思,基于系统生物学的多靶点药物的药物发现理念逐渐成为一种新的趋势。笔者将综述当前在这种趋势下对药物作用的系统性的认识。1选择性药物及其缺陷过去几十年的药物发现主要遵循“一药,一靶,一病”的理念,试图寻找或设计能与疾病相关的某一关键靶标高度特异地结合的化学实体。人们认为,高选择性药物能减轻药物因与不必要的次要靶点结合而产生的毒副作用。但现实有时候却与期望相反,高选择性药物在治疗复杂疾病方面通常很难达到预期效果,或产生严重的毒副作用。据DrugBank数据库统计,至今有60多种经美国食品与药品管理局(FDA)批准的药物或实验药物被撤回。例如,选择性的COX-2抑制剂具有非选择性COX-2抑制剂同样的消炎镇痛作用且较轻的胃肠道不良反应。然而它却导致严重的心血管方面的不良反应,使得大多数这类药物最终被撤回。HMG-CoA还原酶(HMGCR)是胆固醇生物合成途径中的限速酶,被当作降低胆固醇类药物的理想药靶。一系列的HMGCR抑制剂,如洛伐他汀(lovastatin),普伐他汀(pravastatin),西立伐他汀(cerivastatin)等他汀类药物(statins)已在临床上成功用于治疗高胆固醇血症。然而,他汀类药物有可能导致横纹肌溶解症(rhabdomyolysis),其中西立伐他汀服用者中横纹肌溶解症的发生率是其他他汀类药的服用者的16~80倍,因此1998年经FDA批准上市的西立伐他汀于2001年被制药公司撤回。选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂(selectiveserotoninreuptakeinhibitor,SSRI)是一类抗抑郁药物,能有效地抑制神经元从突触间隙中摄取5-羟色胺,增加间隙中可供实际利用的这种神经递质,从而改善情感状态,治疗抑郁性精神障碍。但SSRI类药普遍有导致性功能障碍、失眠、恶心的副作用,其中第1个用于临床的SSRI类药苯吡烯胺(zimelidine),因其导致格林-巴利综合征(Guillain-Barresyndrome),一种严重的神经系统自身免疫性疾病,而被禁用。高选择性药物的开发陷入困境的现象,反映了其遵循的“一药,一靶,一病”开发理念的缺陷。事实上,在细胞内基因与蛋白质倾向于成组地通过网状的相互作用而影响生物系统的功能,而大多数复杂慢性疾病并非是由单个的“致病基因”引起的,而是由多种基因共同影响、导致调控网络失去平衡的后果。例如,2型糖尿病与胰岛素信号基因(insulin-signalinggene)和核受体(nuclearreceptor)两组基因显著相关,而这些基因编码的蛋白通过彼此的相互作用而连接成网络;老年痴呆症与淀粉样前蛋白(amyloidprecursorprotein,APP),早老蛋白1(presenilin1,PS1),早老蛋白2(presenilin2,PS2)以及载脂蛋白E(apolipoproteinE,ApoE)4个蛋白的突变相关;而癌症、心血管疾病的发生、发展则与一系列的蛋白激酶以及它们催化的磷酸化过程的失控有关。高选择性药物的缺陷在于忽视了疾病作为一个系统所具有的复杂性和稳健性,即疾病网络与其他分子网络一样都存在冗余性和替代补偿的信号通路。导致高选择性药物失败的可能原因主要有:①抑制一个靶标不足以引起表型的改变,甚至可能激活疾病系统中的另一相关蛋白,以保护系统功能的稳定,从而导致药物失去功效或产生毒副作用;②单个靶蛋白发生突变导致药物失效,例如BCR-ABL蛋白复合物抑制剂基利克(gleevec)是用于慢性骨髓性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)靶向治疗的药物,却因为BCR-ABL激酶域的突变而产生耐药性,使疗效降低;③抑制单个靶蛋白导致细胞代谢系统的不稳定,从而导致严重的毒副作用,如选择性COX-2抑制剂抑制了前列环素(prostacyclin,PGI2)的生成,但是却无法抑制COX-1诱导生成的血栓烷(thromboxane,TXA2),造成了体内这两种物质的不平衡而产生心血管毒性;④选择性药物与靶蛋白之间高亲和度的结合,使细胞正常的生理功能受到阻碍,从而导致严重的毒副作用,例如治疗老年痴呆症的药物美金刚(emantine)就是一个谷氨酸受体(glutamatereceptor,NMDA)的低亲和抑制剂,它具有其他高亲和性的药物同等疗效同时具有较小的毒副作用;⑤选择性药物与其治疗药靶高度特异性的结合的同时,也可能与其他次级药靶部分结合,从而产生毒副作用,例如万艾可(viagra)特异地抑制PDE-5蛋白,起到治疗肺动脉高血压(pulmonaryarterialhypertension,PAH)和阳痿的作用,但它也部分抑制人眼中与PDE-5结构类似的PDE-6蛋白,造成蓝绿颜色混淆不清、短暂性视力模糊的不良反应。利用网络模型,将药靶置于蛋白相互作用网络中,对比了全面抑制(高亲和抑制)单个靶点和部分抑制(低亲和抑制)多个靶点对网络功能的影响。他们发现,在网络环境中,多靶点低亲和抑制策略明显优于单靶点高亲和抑制的策略,即多靶点药物同时作用于疾病网络中的多个相关蛋白,从而产生协同效应,使总效应大于各单效应之和,达到更好的治疗效果。综上所述,将药物研究与系统生物学结合,在各种调控网络的背景中研究多个基因(靶点)之间的作用与联系,考虑信号转导通路和功能系统的调控,将是有效地开发治疗复杂疾病的药物的潜在有效途径。2n种药物组合的中效模型多组分药物组合治疗是利用多个活性分子同时作用于多个靶蛋白,从而对疾病进行调控。这种方法已显示了在治疗复杂疾病方面的良好效果,成功的例子如艾滋病的鸡尾酒疗法、高血压、癌症的组合用药等。多组分药物的多个活性分子间相互作用,产生的药物终效应可能大于、等于或小于其各个成分的作用之和,从而该药物合用结果分别被称为协同、加和或拮抗。一些药物组合分析方法已建立起来,帮助设计药物实验并分析实验结果,寻找能产生协同作用的药物组合。这里介绍常用的一些方法。常见的多组分药物与临床中同时使用多种药物的原理一致,即每种活性成分可单独用于治疗相同的疾病。例如FDA于2007年批准的抗高血压的多组分药氨氯地平(exforge)就是血管紧张素受体阻滞剂(angiotensinreceptorblocker,ARB)和钙通道阻滞剂(calciumchannelblocker,CCB)的组合。通过评判药物组合产生的效应是否高于大剂量地单用其中任一组分所产生的Loewe加和(loeweadditivity)水平,可判断这种药物合用是否产生协同作用。Chou和Talalay提出的合用指数即可用于这种情况。对N种药物的组合,首先利用下面的中效方程,确定其中每种药物的剂量-效应曲线:其中D是药物剂量,fa是药物在剂量D下的作用效应百分比,Dm代表产生中效作用的剂量(即ED50值),m是剂量-效应曲线常数。对组合中的每种药物,分别通过不同剂量下的k次实验,获得k组(D,fa)值,带入(1)式作线性回归,即可求得该药物的m和Dm值。对N种药物的组合,设产生效应x时的合用指数定义为:其中Dj为N药合用产生效应x时第j种药的剂量,(Dx)j是第j种药单独使用产生效应x所需的剂量,fax是此时N药合用的作用效应百分比,(Dm)j和mj分别是第j种药的中效作用剂量和剂量-效应曲线常数。(CI)x小于、等于和大于1代表该N药组合的合用结果分别是协同、加和及拮抗。另一类的多组分药物中,至少有一种活性成分的作用与治疗目标疾病无关,或不能单独用于治疗目标疾病,但与其他成分组合后却对目标疾病产生了更好的治疗效果。例如抗生素安美汀(augmentin)是阿莫西林和克拉维酸钾的组合(amoxicillin+clavulanatepotassium)。克拉维酸为β-内酰胺酶抑制剂,本身并无抗菌作用,当与阿莫西林联用时,可保护阿莫西林不被耐药菌产生的β-内酰胺酶灭活,使其发挥更强的抗菌作用。抗精神病药物氯丙嗪(chlorpromazine)与抗原虫药物戊烷咪(pentamidine)单独使用均没有抗癌能力,但它们的组合表现出比临床使用的抗癌药紫杉醇(paclitaxel)更高的抗癌活性。对这类药物组合,因无法定量确定其中某些单成分对目标疾病的计量-效应曲线,就不能用合用指数判定其协同效应。此时可以用基于作用效应的模型如HSA(highestsingleagent)模型和Bliss加和模型(blissadditivismmodel)。设两种药物单独使时的作用效应百分比分别是A,B,用HSA模型和Bliss加和模型预测的两药合用的加和效应C分别是:若两药合用的实际效应大于C,则认为它们产生了协同作用,反之则是拮抗作用。一直以来,发现协同作用的药物组合通常是基于临床经验和试错的方法。近几年,人们开始尝试进行系统性地筛选。CombinatoRx公司的科学家Keith等开发了组合高通量筛选(combinationHigh-ThroughputScreening,cHTS)技术,对候选药物之间的大约120000种两两组合系统性地进行了药效筛选,发现了一些具有较高治疗价值的两成分药物组合,如将抗精神病药物氯丙嗪与抗原虫药物戊烷咪组合而产生显著抗癌活性,就是他们通过系统性的组合药效筛选发现的。由于药物的治疗效果依赖于剂量,对组合中每个成分都要测试多个剂量水平的药效,如Keith等的实验就测试了6个剂量水平。当候选药物数量增大,且不限于两两组合而是考虑更多种药物的组合时,穷举法就面临组合爆炸的问题。考虑到即使候选药物库很大,其中也仅有少数组合能产生显著好于单一药物的作用,一些研究组开展了优化算法指导下的组合筛选,如closed-loop优化方法、顺序解码算法(sequentialdecodingalgorithm)、MACS(MedicinalAlgorithmicCombinatorialScreen)方法等。这类方法的原理是在药物组合-药物效应构成的参数空间进行迭代搜索,每次迭代通过算法基于过去的结果,求出一些优化组合进行效应验证实验,并将结果反馈给算法以进行下一次迭代,直至得到效应最优的组合。Wang等提出了基于定量组分活性关系(quantitativecomposition-activityrelationship,QCAR)的多组分药物设计方法。他们首先用单纯形格点设计(simplexlatticedesign)方法,安排多个组分在不同剂量水平的一些组合进行实验,得到了药物组合-效应参数空间的一些有代表性的值,接着以这些实验结果作为输入,通过多元回归的方法模拟出药物组合与效应之间的函数关系,即效应曲面(responsesurface),最后用优化计算方法求出效应曲面的最优解。此即预测的最优组合方案,可供进一步实验验证。这里介绍的方法在一定程度上是类似黑箱的方法。虽然从效应上找到许多有效的药物组合,但很多情况下其作用机制仍然难以解释。而构建疾病基因和药物作用靶标的生物学网络模型,有助于从机制上找到好的靶标及药物组合。3基于代谢网络的最优酶靶识别许多复杂疾病的发生、发展都与一系列相互作用的蛋白相关。近年来,在网络背景下研究疾病已成为一个热点。通过整合包括基因组、转录组、蛋白质组等多种数据来源,结合各种数学模型和计算方法,人们建立了一系列复杂疾病相关的网络,如糖尿病网络、癌症网络、哮喘网络、老年痴呆症网络等。这些网络不但有助于了解疾病机制,对于多靶点及多组分药物的研究也具有很高的价值。网络生物学的研究已证实,细胞网络的拓扑结构与它所代表的生物学系统的功能和性能密切相关。因此疾病相关网络的拓扑结构以及蛋白在网络中所处的位置,是识别潜在靶标组合时需要考虑的重要因素。一些量化衡量网络中结点或边位置重要程度的指标被用来识别潜在靶标。网络中与某顶点相连的边的数量称为该顶点的连接度(degree),而介数(betweenness)则是衡量网络结点参与其他结点对之间信息交流程度的一个指标。Hwang等构建了一个与哮喘相关的蛋白之间的相互作用网络,并研究了该网络中连接度和介数最高的一些蛋白,发现这些蛋白或者是与哮喘相关的信号通路上的重要分子,或者与一些已知的哮喘药靶有直接的相互作用,说明这些蛋白可能作为哮喘药物的药靶。窒息点(chokepoint)是网络中的瓶颈,在代谢网络中代表只催化一个底物或只生成一个产物的酶。Rahman等发现细菌代谢网络中的窒息点是抗生素类药的潜在药靶。桥接点(bridgingnode)是网络中不同的稠密子网络(模块)之间的连接点。Hwang等从干预网络系统的有效性及产生较小副作用的角度,发现细胞网络的桥接点是潜在的药物干预位点。Dezso等以全基因组蛋白相互作用网络为背景,构建了银屑病的差异表达基因之间的最短路网络,对该最短路网络的每个内部结点赋予一个“拓扑显著性分值”,量化评价它对连接差异表达基因的拓扑重要性。他们发现,拓扑显著性分值最高的蛋白中,有很大比例是目前使用的银屑病药物的药靶。药物的若干靶蛋白之间通过相互作用,形成细胞系统的子网络。识别这样的子网络,有助于在系统水平上评估药物的整体影响,以及寻找有效的药物组合。Hopkins构建了文献报道的与哮喘病治疗相关的44个靶蛋白的相互关系网络。利用此网络可研究哮喘病的多组分药物组合治疗方案。Wu等提出一个整数规划方法,分别构建了抗糖尿病药物二甲双胍(metformin)和罗格列酮(rosiglitazone)作用下的差异表达基因的子网络,由此预测它们合用的多组方药物罗格列酮二甲双胍(avandamet)所影响的子网络,显示了avandamet具有更好的抗糖尿病效应。从细胞网络调控的角度看,药物若要达到既有效治疗疾病、同时又产生尽量小的毒副作用的效果,应该通过干预尽量少的蛋白,抑制因异常活跃而导致疾病的生化反应或信号通路集,同时不影响正常的反应或通路集。基于此原理而建立的数学模型和优化算法,如最小敲除问题(theminimumknockoutproblem),最小干涉问题(themin-interferenceproblem),基于代谢网络的最优酶靶识别(OPMET)模型,改进的McMillan展开算法(McMillan′sunfoldingalgorithm)能识别潜在的靶标组合。细胞信号或代谢网络的动力学模型由一组微分方程构成,可以预测网络中参与反应的物质的浓度随时间变化的规律,而通过改变反应的动力学常数可以模拟外界扰动如药物作用等对网络的影响。Yang等建立了多靶最优干预(multipletargetoptimalintervention,MTOI)算法,用花生四烯酸代谢通路的动力学模型,模拟抑制该通路上不同的酶组合时,网络从疾病状态向治愈状态的转变过程,寻找优化的抗炎药靶组合。Araujo等则利用表皮生长因子受体信号网络(EGFRsignalingnetwork)的动力学模型,模拟了同时抑制该网络上的多个蛋白激酶所产生的协同效应。这类基于网络动力学模型的算法能更好地定量模拟药物对疾病网络的影响。但问题是目前已建立的疾病相关网络的动力学模型是有限的,其中一大难点是模型中的动力学参数需要通过实验确定或计算估计。BioModels数据库收集了文献报道的动力学模型,其中的模型以SBML,CellML,XPP,SciLab,BioPAX等标准格式供用户免费下载使用。Schulz等开发了一个软件TIde(TargetIdentification),该软件允许用户输入自己建立的或来自BioModels数据库的SBML格式的网络模型,通过模拟对该网络中不同组合反应的抑制效果,确定网络中最优的靶点组合。4基于中药的作用机制认识传统中药已有悠久的历史,并积累了大量临床有效的方剂。在治疗复杂慢性疾病方面,中药因其确切的药效和较小的毒副作用,相对现代西药有独到优势。例如,经严格的随机双盲临床实验验证,中药复方汉方小柴胡汤可以降低肝硬化病人发生肝癌的几率。而临床资料统计显示,中药复方黄黛片(Realgar-Indigonaturalisformula,RIF)用于治疗急性早幼粒细胞性白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL),用药60d的肿瘤完全缓解率(completeremissionrate,CR率)达98.3%。经随机双盲、安慰剂对照的临床试验显示,银杏叶提取液在缓解轻微到中度阿尔茨海默病(Alzheimer′sdementia,AD)方面,具有与第二代胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐(donepezil)相似的效果。目前,药物发现领域有一种向传统药物获取资源和灵感的趋势。由于采用天然产物为原料,传统药物是极有价值的、经临床检验有效的天然混合药物资源库。但面临的巨大挑战是,传统药物来自长期的经验和实践,至今人类对这些药物的治病机制知之甚少。如果能用现代生物学的研究手段,从现代生物医学的角度阐明传统药物的机制,就有可能用反向药理学的方法,从传统药物出发开发化学成分和作用机制明确的现代药物。目前广泛使用的基因芯片、蛋白质组学、代谢组学等高通量的组学实验技术,使得从系统生物学的角度认识传统药物的作用机制成为可能。例如,PC-SPES是包含8种不同草药提取物的复方植物药制剂,体内、体外实验和临床试验显示,PC-SPES对前列腺癌细胞有抑制作用。Bonham等用cDNA芯片分析技术,确定了经PC-SPES处理后LNCaP前列腺癌细胞中差异表达的156个基因。分析这些基因的功能,揭示了PC-SPES的抗癌作用主要是通过调节细胞周期、细胞结构以及雄激素响应等相关的通路来实现的。但是,PC-SPES中究竟是哪些成分起到了治疗作用,仍然不得而知。一副中药复方方剂是多种天然产物的合理组合,其中每种天然产物都含有多种化学成分。从分子水平上看,中药的作用具有多组分、多靶点的特点,即在本质上与多组分药物的组合疗法相同。因此,借鉴目前关于多组分、多靶点药物的研究方法和成果,将有助于从现代生物学角度认识中药的作用机制,以及从疗效确切的中药开发化学成分和作用机制明确的现代药物。为此我们提出了基于系统生物学的中药药理学的研究路线(见文献图1)。该研究路线主要由以下部分组成:(1)分析中药的主要活性成分。一些现代分离分析技术如中压液相色谱(mediumpressureliquidchromatography,MPLC)、高压液相色谱(highpressureliquidchromatography,HPLC)、高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchromatography,HSCCC)等已广泛用于中药活性成分的分析与分离(详见文献附表4)。本实验室用血清药理学方法,开展了麝香保心丸的体内分析,从中发现了21个入血药效成分构成了有效物质组,其中包括17个药物原型成分和4个代谢成分,并根据药理活性研究结果,从中筛选了13个入血成分进行进一步的组分配伍研究。在文献附表5中我们列出了目前主要活性成分已知的中药复方。②在了解目标疾病的致病基因以及蛋白网络的基础上,分析中药各成分的在疾病网络上的作用靶点。在文献的附表1中,我们列出了目前已构造的约50种复杂疾病的蛋白网络。利用基因芯片技术或蛋白质组学技术,通过比较对照细胞或动物组织在正常状态、疾病状态及药物干预后基因或蛋白质表达谱的差异,可能找到中药(或其活性成分)的可能靶点相关基因或蛋白。另外,计算机虚拟筛选技术通过比较化合物间结构相似性、或模拟小分子与蛋白质在空间的结合,也可用于中药中活性化合物的靶点预测。③认识中药各成分间以及各靶点间的相互作用,从而描绘出中药有效分子组合如何对机体生物分子网络进行广泛调节的路线图。利用网络生物学的方法和技术,识别这些药靶蛋白所在的信号通路和调控网络,并分析它们在这些网络中所处的地位和起到的作用,以及靶蛋白间的相互作用关系,可以帮助我们认识中药的作用机制。利用药物组合协同作用的分析方法,可望找到中药中产生协同作用的有效成分。灵芝在临床中用于预防和治疗包括癌症在内的多种疾病。Yue等应用蛋白组学方法研究了灵芝中主要的三萜类化合物灵芝酸D(ganodericacidD,GAD)对于HeLa细胞的细胞毒性作用机制。通过比较GAD作用后细胞和对照细胞的蛋白表达谱,寻找到GAD作用后表达水平发生显著性改变的21个蛋白,这些就是GAD可能的作用靶点,并构建了这21个蛋白之间的相互作用网络。该研究结果揭示了14-3-3蛋白、eukaryotictranslationinitiationfactor5A蛋白和thioredoxin-dependentperoxidereductase蛋白在灵芝酸D的细胞毒性作用中的重要地位。治疗急性早幼粒细胞性白血病的复方黄黛片由4味中药组成,其主要活性成分是四硫化砷(As4S4,A),靛玉红(indirubin,I)和丹参酮IIA(tanshinoneIIA,T)。