原生质体融合技术在优良酿酒酵母研究中的应用

原生质体融合技术在优良酿酒酵母研究中的应用

母乳喂养是酒精工业的灵魂。良好的酵母不仅可以保证产品的质量,还可以提高生产效率,降低生产成本。因此,选育优良的酵母菌株,改善酵母菌的生产性能,对酿酒工业尤为重要。但是,由于工业用酵母菌株优良特性的遗传控制背景十分复杂,同时由于长期人为培养使用等原因,很多菌株已丧失了产生孢子能力或成为孢子不育株,这使得传统杂交育种和现代的基因工程育种手段都受到一定程度的限制。而原生质体融合技术可克服细胞壁的天然屏障,排除接合型的限制,实现多基因重组,还可直接采用生产性状好的菌株作为亲株,加速工业酵母菌种改良进程,为优良工业酵母的选育提供了一个崭新的途径。1助融作用的融合原生质体融合(protoplastfusion)也称细胞融合(cellfusion),是将双亲株细胞通过酶解破壁(动物细胞除外),使之成为球状的原生质体,然后等量混合于高渗缓冲液中,在物理的(如电融合)或化学的(如聚乙二醇)或生物的(如仙台病毒)助融作用下,使双亲的原生质体发生相互凝集,通过细胞质融合(plasmogamy)、核融合(karyogamy),进行基因组建的交换、重组,然后在适宜的条件下再生出细胞壁,获得融合子(fusant)的过程。应用原生质体融合技术进行酵母菌育种一般包括以下几个步骤:融合亲株的筛选、融合子筛选方法的确定、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的筛选与鉴定、融合株生产性能的测试等。2原生质体融合的探索1912年Lamnbent在观察多核细胞形成的过程时发现了细胞融合现象。此后,Muller和Barski也相继观察到了细胞融合现象。1958年Okada发现并证明了紫外灭活仙台病毒可诱发体内艾氏腹水癌细胞彼此融合,开拓了细胞融合研究的先河。1953年,Weibull等首次用溶菌酶制备得到了巨大芽孢杆菌的原生质体,并提出了原生体的概念。之后Eddy,Emmerson,Cocking又以酶法相继制备出了酵母菌、丝状真菌和番茄幼根细胞的原生质体,为微生物和植物的细胞融合开辟了道路。1974年,加拿大籍华人高国楠发现聚乙二醇(PEG)在Ca2+参与下能促进植物细胞原生质体融合,这一发现极大地促进了细胞融合技术的发展。以后又发展了电场诱导融合法、激光诱导融合法。1978年,第三届工业微生物遗传学讨论会上,把原生质体融合作为一种新的基因重组手段提出来,引起了全世界的关注。此后,越来越多的研究者认识到它的重要应用价值,不断提出并完善了一系列技术方法,并将其运用到微生物的遗传、生理、代谢、形态方面的研究和工业菌株选育工作中,极大地推动了微生物研究的进程。3酿酒酵母的应用自1977年Sipiczki等首次实现了酵母原生质体融合以来,国内外研究者开展了广泛的研究,已成功地实现了酵母的种、属间的融合,构建了一些有重要应用价值的酿酒酵母。有的研究者还进行了酵母与霉菌、酵母与细菌的融合,极大地丰富了酵母的遗传多样性,促进了酵母菌的形态、生理和遗传研究,加速了优良工业酵母菌株的选育。3.1糖化酵母融合子的检测酿酒酵母缺乏编码淀粉水解酶的基因,不能直接利用淀粉生产酒精。而糖化酵母、黑曲霉、内孢霉等则可分泌淀粉酶,水解淀粉。糖化性状的表达受多基因控制,且受到杂合型a/α的限制。应用原生质体融合技术,将其它菌株中的糖化基因转入酿酒酵母中,则将大大缩短工艺流程,降低生产成本。国内研究者将酿酒酵母和糖化酵母等具有淀粉酶活性的菌株进行种、属间融合,构建出一些具有淀粉糖化酶活性的酵母菌株[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。左小明等研究发现,STA1、STA2、STA3的剂量效应并不总是随着核倍性递增,而只有当各自纯合时才表现出表达的剂量效应;Masaokishida等在研究S.fibuligera和糖化酵母融合时发现,融合子染色体电泳迁移方式只有细微的差别,α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶编码基因的DNA杂交结果表明,这两种基因在融合重组时或是被复制或是被消除,导致融合子形成了嵌和型染色体。李桃生等认为酿酒酵母和糖化酵母亲缘关系较近,容易形成稳定的融合子。研究发现,酿酒酵母与Aureobasidiumpullulans、Endomycesfibuligena、S.fibuligera、Endomycopsisfibnligera、Candidatropicalis等进行的属间融合不易获得稳定的融合子。黎碧莲等为提高属间融合子的稳定性,避免糖化酶分泌性状发生分离,采用间接选择法,以糊精发酵为选择压力,促使融合子向发酵淀粉原料方向稳定。在啤酒酵母应用方面,陈海昌等将啤酒酵母(S.carlsbergenisis)和糖化酵母进行融合,获得了具有糖化能力的啤酒酵母。3.2酵母菌种的培养酒精发酵过程中,由于环境高温和发酵过程放热等原因,造成发酵醪温度过高,普通酵母难以进行正常的生长和发酵,衰老过程加快,出酒率低,必须外加制冷设备维持正常的生产。应用原生质体融合技术,将某些耐高温菌株与工业菌株融合,构建耐高温产酒率高的酵母菌株,具有重大的现实意义。日本的品川早苗最早将高产酒精酵母和耐高温酵母进行种内融合,得到了可以在40℃产酒精的酵母;随后,国内外研究者开展了一系列研究,实现了种属间融合,构建了一些耐高温菌株[13,14,15,16,17,18,19]。文铁桥等将酿酒酵母与呼吸缺陷型耐高温克鲁维酵母融合,在TTC培养基上筛选,得到的融合子在45℃产酒率可达7.4%。孙君社等采用呼吸缺陷型遗传标记结合高温(45℃)条件培养对融合产物进行筛选,得到了稳定的融合子。杨汝德等利用加热(80℃,30min)和紫外线照射(功率30w,距离30cm,2min)灭活双亲后进行融合,获得了成功,彻底避免了遗传标记对亲株生产性状造成的不利影响,为原生质体融合技术在工业酵母菌株育种上的广泛应用开辟了新的途径。3.3高效利用嗜杀酵母酒类酿造过程中,常常易出现酵母杂菌污染的情况,轻者影响了产品的质量,重者造成巨大的浪费,严重影响企业的经济效益。嗜杀酵母细胞内具有嗜杀质粒,控制菌体分泌毒素,可杀死敏感菌株。将嗜杀酵母中的嗜杀质粒转移到具优良发酵特性的菌株中,对防治酵母污染,净化发酵体系,具有重要意义。BortolA等将经紫外线灭活的嗜杀酵母与糖化酵母融合,再利用嗜杀酵母对融合产物进行筛选,得到了糖化型嗜杀酵母。以后,杜连祥等,SuloP等,王昌禄等也进行了探索,获得了具有嗜杀活性的啤酒酵母。杜金华等选择具有核缺陷的嗜杀菌株(kar1-1,his4)作为供体成功地将嗜杀质粒转移到了苹果酵母中,避免了嗜杀质粒转移时引起不必要的核基因改变,为细胞质基因的有效转移提供了可靠途径。3.4酵母原生质体融合子选育酵母细胞的絮凝性是衡量优良酵母生产菌株的一个重要指标。良好的絮凝性不仅能加快发酵液的澄清速度,降低酵母分离能耗,而且还可以防止因酵母自溶所导致的风味败坏。将絮凝性酵母与非絮凝性酵母进行融合重组,提高优良酵母的絮凝性,对啤酒生产具有重大意义。deFigueroa等,江慧修等,陈海昌等,JavadekarVS等,周东坡等及Watari等将非絮凝性酵母与絮凝性强的酵母进行原生质体融合,获得了絮凝性好、发酵力强的融合子。其中,江慧修等利用红霉素抗性突变和小菌落呼吸缺陷突变作为筛选标记,将发酵力强的酵母与絮凝性好的酵母进行电诱导融合,所得融合子经凝集性、发酵力、细胞表面疏水性能、细胞DNA含量、稳定性测定和小型发酵试验证明,具有双亲的优良性状。同时也证明,诱导线粒体基因突变标记对工业菌株进行原生质体融合育种是一种有效途径。JavadekarVS等利用benomyl(一种真菌毒素)抗性作为筛选标记,将嗜杀酵母和高絮凝性酵母融合,得到了絮凝性好的嗜杀酵母,但在甘蔗糖蜜中发酵试验,絮凝性状消失,其原因尚不清楚。3.5酵母菌种的选择在降解苹果酸强的葡萄酒酵母和增香酵母选育上也有研究者进行了探索。高年发等将酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)进行属间融合,选育出降解苹果酸能力强的葡萄酒酵母。王瑞明等,赵华等将异常汉逊酵母异常变种(Hansenulaanomala)产乙酸乙酯能力部分地转到酿酒酵母中,得到了产香能力强的酵母菌株;日本学者Munekazukishimoto将嗜冷酵母与中温酵母融合,构建出低温果酒增香酵母,发酵试验证明,苹果酸、乙醇、苯乙醇、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯的产率较中温酿酒酵母有所提高。因为控制酵母发酵产香性状的基因众多,很难利用转基因、定点突变等技术进行构建,所以通过原生质体融合技术构建增香酵母最有可能解决某些果酒上长期存在的香气不足的问题。4原生质和生物化合技术的应用前景和现有问题4.1原生质体融合技术酿酒工业一般要求所使用的酵母具有耐高温/低温、耐酒精、高产酒精、糖化能力强、嗜杀、产香、絮凝性好等优良的生产性状。生产不同产品所需的酵母性状有所不同,但每一种产品的生产都需要具有多种优良性状的菌种,而真正具有多种优良性状的菌株又寥寥无几。应用原生质体融合技术,实现多种优良性状的整合,构建出理想的酵母菌株,将对酿酒工业的发展具有重要的意义。而且,通过原生质体融合技术进行优良酵母菌选育的同时,还可以通过对融合子的遗传分析,研究产量性状的表达机制,各种性状之间的影响以及各种代谢途径中关键控制酶的作用,从而更加深入的研究酵母的发酵性能,提高生产